人参皂苷Rg1的神经保护作用机制研究 中外核心期刊查询
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帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元功能障碍[1,2]。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制密切相关。目前对PD的治疗手段不断发展，可分为药物治疗、基因治疗和外科治疗等，但药物治疗长期应用后的副作用、外科手术治疗的昂贵及远期疗效的不确定性，使得各国学者试图从不同的角度入手，探寻新的治疗方法。人参皂苷是人参的主要活性成分，包含有30多种人参单体，如Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc等，Rg1在人参皂苷中的含量丰富。近年来的研究显示，人参皂苷Rg1具有多种生物活性[3,4]，特别是在中枢神经系统，Rg1具有神经营养和神经保护作用。本研究室的前期实验已揭示Rg1可以对抗6 OHDA对MES23.5神经元的损伤[5]，为了进一步探讨人参皂苷Rg1对抗6 OHDA毒性作用的机制，本研究应用6 OHDA损伤MES23.5神经细胞，建立PD细胞模型，并应用人参皂苷Rg1进行干预，从细胞和分子水平探讨6 OHDA诱导神经毒性的信号途径以及Rg1的保护效应，以期为人参皂苷Rg1的神经保护作用机制提供进一步的实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂及其来源
纯度为99.9%人参皂苷Rg1购自白求恩医科大学;DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);6 OHDA购自Sigma公司(美国);抗Akt抗体购自Santa Cruz公司(美国);抗磷酸化Akt抗体购自购自Cell signaling公司(美国);LY294002购自Tocrics公司(美国);ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。
1.2 细胞培养及药物处理
MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数0.05的CO2条件下培养。当细胞融合达80%～90%时，分别用在有或无LY294002 (10 μmol/L)存在的情况下，应用Rg1(10-8mol/L)预保护24 h,然后再给予6 OHDA(100 μmol/L)，共分为对照组、6 OHDA组、Rg1+6 OHDA组及Rg1+LY294002+6 OHDA组。
1.3 MTT法检测细胞生长
将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，在有或者无LY294002共存情况下，先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6 OHDA处理，24 h后去除培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱继续培养4 h，每孔中加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测波长570 nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率。
1.4 免疫印迹法检测pAkt和Akt蛋白的表达
将传代细胞接种于6孔板中，6 OHDA组用6 OHDA(100 μmol/L)处理细胞0.5、1、2、4、6 h。Rg1预保护组先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6 OHDA处理细胞0.5、1、2、4、6 h，去掉培养液，收集细胞，2 000 r/min离心5 min，沉淀细胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制剂(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin, 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制剂(1 mmol/L sodium orthovanadate,10 mmol/L NaF)Nonidet P 40(20 mmol/L Tris HCl, pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L CaCl2;1 mmol/L MgCl2; 体积分数0.10 的glycerol; 体积分数0.01的Nonidet P 40)溶液裂解细胞。应用Bradford试剂测定蛋白浓度，取20 μg的蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5 min，在100 g/L SDS PAGE凝胶上电泳，然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。以体积分数0.05脱脂奶粉室温封闭2 h后与抗pAkt(1∶1 000)或抗Akt(1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜，继以羊抗兔IgG HRP二抗孵育2 h，使用ECL化学发光试剂进行检测，用pAkt/Akt的灰度比值代表Akt的磷酸化活性。
1.5 统计学分析
本文结果的数据以均数±标准差表示，应用Graph Pad Prism 5.0统计软件进行单因素方差分析(One Way ANOV)，以Tukey法进行两两比较。
2 结 果
2.1 人参皂苷Rg1对抗6 OHDA对MES23.5神经元损伤的作用
6 OHDA组细胞存活率为0.732±0.060，与对照组(1.000±0.075)相比，细胞存活率下降26.8%，差异有显著性(F=25.12,q=7.604,P<0.01)。应用10-8mol/L Rg1预处理细胞24 h，可明显对抗6 OHDA的毒性作用，细胞存活率为0.900±0.044，较6 OHDA组升高23.0%，差异有极显著性(q=4.768，P<0.05)。MES23.5细胞经人参皂苷Rg1和LY294002预处理24 h后，再与6 OHDA共同作用24 h，结果显示细胞的存活率为0.602±0.062，与6 OHDA组比较无显著差异。说明PI3K特异性抑制剂LY294002可以完全阻断Rg1对MES23.5细胞的保护作用。
2.2 6 OHDA对MES23.5细胞pAkt表达的影响及Rg1的保护作用
MES23.5细胞经100 μmol/L的6 OHDA处理0.5、1、2、4、6 h后，6 OHDA可以时间依赖性地降低pAkt的表达(F=24.51，P<0.01),Rg1+6 OHDA组pAkt表达明显增强,在0.5 h差异有显著性(t=471.60，P<0.01)。提示Rg1可通过增强PI3K/Akt信号通路的活性，对抗6 OHDA的毒性作用。见表1。表1 Rg1预处理对6 OHDA诱导的MES23.5细胞pAkt表达的影响
3 讨 论
人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分，药理学研究表明，Rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用。近年来的研究显示，人参皂苷Rg1具有神经营养和神经保护作用，Rg1能够对抗MPTP对小鼠黑质纹状体系统多巴胺神经元的损伤，其机制与抗凋亡和抗氧化应激有关。本研究室的前期工作已证实Rg1对神经毒素6 OHDA诱导的大鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元的损伤具有明显的保护作用[4]。体外细胞实验亦证实，Rg1可以对抗6 OHDA对杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系MES23.5细胞的损伤[5]。为了进一步探讨人参皂苷Rg1神经保护作用的信号通路，本研究应用6 OHDA诱导MES23.5神经元细胞的损伤，观察6 OHDA对细胞存活率及磷酸化Akt表达的影响及人参皂苷Rg1的保护作用。结果显示，6 OHDA对MES23.5细胞具有明显的毒性作用，可以降低细胞的存活率。6 OHDA可以时间依赖性地降低磷酸化Akt的表达，应用人参皂苷Rg1可以明显对抗6 OHDA的毒性作用，提高pAkt的表达，应用PI3K特异性抑制剂LY294002进一步揭示Rg1的神经保护作用与PI3K/Akt信号通路的激活有关。
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帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元功能障碍[1,2]。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制密切相关。目前对PD的治疗手段不断发展，可分为药物治疗、基因治疗和外科治疗等，但药物治疗长期应用后的副作用、外科手术治疗的昂贵及远期疗效的不确定性，使得各国学者试图从不同的角度入手，探寻新的治疗方法。人参皂苷是人参的主要活性成分，包含有30多种人参单体，如Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc等，Rg1在人参皂苷中的含量丰富。近年来的研究显示，人参皂苷Rg1具有多种生物活性[3,4]，特别是在中枢神经系统，Rg1具有神经营养和神经保护作用。本研究室的前期实验已揭示Rg1可以对抗6 OHDA对MES23.5神经元的损伤[5]，为了进一步探讨人参皂苷Rg1对抗6 OHDA毒性作用的机制，本研究应用6 OHDA损伤MES23.5神经细胞，建立PD细胞模型，并应用人参皂苷Rg1进行干预，从细胞和分子水平探讨6 OHDA诱导神经毒性的信号途径以及Rg1的保护效应，以期为人参皂苷Rg1的神经保护作用机制提供进一步的实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂及其来源
纯度为99.9%人参皂苷Rg1购自白求恩医科大学;DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);6 OHDA购自Sigma公司(美国);抗Akt抗体购自Santa Cruz公司(美国);抗磷酸化Akt抗体购自购自Cell signaling公司(美国);LY294002购自Tocrics公司(美国);ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。
1.2 细胞培养及药物处理
MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数0.05的CO2条件下培养。当细胞融合达80%～90%时，分别用在有或无LY294002 (10 μmol/L)存在的情况下，应用Rg1(10-8mol/L)预保护24 h,然后再给予6 OHDA(100 μmol/L)，共分为对照组、6 OHDA组、Rg1+6 OHDA组及Rg1+LY294002+6 OHDA组。
1.3 MTT法检测细胞生长
将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，在有或者无LY294002共存情况下，先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6 OHDA处理，24 h后去除培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱继续培养4 h，每孔中加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测波长570 nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率。
1.4 免疫印迹法检测pAkt和Akt蛋白的表达
将传代细胞接种于6孔板中，6 OHDA组用6 OHDA(100 μmol/L)处理细胞0.5、1、2、4、6 h。Rg1预保护组先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6 OHDA处理细胞0.5、1、2、4、6 h，去掉培养液，收集细胞，2 000 r/min离心5 min，沉淀细胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制剂(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin, 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制剂(1 mmol/L sodium orthovanadate,10 mmol/L NaF)Nonidet P 40(20 mmol/L Tris HCl, pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L CaCl2;1 mmol/L MgCl2; 体积分数0.10 的glycerol; 体积分数0.01的Nonidet P 40)溶液裂解细胞。应用Bradford试剂测定蛋白浓度，取20 μg的蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5 min，在100 g/L SDS PAGE凝胶上电泳，然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。以体积分数0.05脱脂奶粉室温封闭2 h后与抗pAkt(1∶1 000)或抗Akt(1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜，继以羊抗兔IgG HRP二抗孵育2 h，使用ECL化学发光试剂进行检测，用pAkt/Akt的灰度比值代表Akt的磷酸化活性。
1.5 统计学分析
本文结果的数据以均数±标准差表示，应用Graph Pad Prism 5.0统计软件进行单因素方差分析(One Way ANOV)，以Tukey法进行两两比较。
2 结 果
2.1 人参皂苷Rg1对抗6 OHDA对MES23.5神经元损伤的作用
6 OHDA组细胞存活率为0.732±0.060，与对照组(1.000±0.075)相比，细胞存活率下降26.8%，差异有显著性(F=25.12,q=7.604,P<0.01)。应用10-8mol/L Rg1预处理细胞24 h，可明显对抗6 OHDA的毒性作用，细胞存活率为0.900±0.044，较6 OHDA组升高23.0%，差异有极显著性(q=4.768，P<0.05)。MES23.5细胞经人参皂苷Rg1和LY294002预处理24 h后，再与6 OHDA共同作用24 h，结果显示细胞的存活率为0.602±0.062，与6 OHDA组比较无显著差异。说明PI3K特异性抑制剂LY294002可以完全阻断Rg1对MES23.5细胞的保护作用。
2.2 6 OHDA对MES23.5细胞pAkt表达的影响及Rg1的保护作用
MES23.5细胞经100 μmol/L的6 OHDA处理0.5、1、2、4、6 h后，6 OHDA可以时间依赖性地降低pAkt的表达(F=24.51，P<0.01),Rg1+6 OHDA组pAkt表达明显增强,在0.5 h差异有显著性(t=471.60，P<0.01)。提示Rg1可通过增强PI3K/Akt信号通路的活性，对抗6 OHDA的毒性作用。见表1。表1 Rg1预处理对6 OHDA诱导的MES23.5细胞pAkt表达的影响
3 讨 论
人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分，药理学研究表明，Rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用。近年来的研究显示，人参皂苷Rg1具有神经营养和神经保护作用，Rg1能够对抗MPTP对小鼠黑质纹状体系统多巴胺神经元的损伤，其机制与抗凋亡和抗氧化应激有关。本研究室的前期工作已证实Rg1对神经毒素6 OHDA诱导的大鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元的损伤具有明显的保护作用[4]。体外细胞实验亦证实，Rg1可以对抗6 OHDA对杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系MES23.5细胞的损伤[5]。为了进一步探讨人参皂苷Rg1神经保护作用的信号通路，本研究应用6 OHDA诱导MES23.5神经元细胞的损伤，观察6 OHDA对细胞存活率及磷酸化Akt表达的影响及人参皂苷Rg1的保护作用。结果显示，6 OHDA对MES23.5细胞具有明显的毒性作用，可以降低细胞的存活率。6 OHDA可以时间依赖性地降低磷酸化Akt的表达，应用人参皂苷Rg1可以明显对抗6 OHDA的毒性作用，提高pAkt的表达，应用PI3K特异性抑制剂LY294002进一步揭示Rg1的神经保护作用与PI3K/Akt信号通路的激活有关。
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