大鼠急性痛风性关节炎模型应用穿山龙效果 2012核心期刊目录查询
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随着生活水平的提高,痛风的患病率不断增加。急性痛风性关节炎是痛风最常见的表现形式[1]。目前，治疗急性痛风发作的药物主要有非甾体消炎药（NSAID）、秋水仙碱、糖皮质激素等，但其药物不良反应多。中药治疗急性痛风性关节炎日益引起关注。本文建立大鼠急性痛风性关节炎模型，应用穿山龙进行治疗，观察其疗效。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠56只，10周龄，体质量（200±20）g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，实验前适应性喂养1周，饮食、饮水、活动正常，无不良反应即开始实验。整个实验过程中大鼠均自由摄食和饮水。
1.1.2 主要试剂 穿山龙中药饮片（毫州市凯利中药饮片有限公司生产），尿酸(Alfa Aesat)，秋水仙碱片（西双版纳版纳药业有限责任公司生产），吐温80（Sigma 分装，C283），大鼠白细胞介素1β（IL 1β）酶联免疫吸附反应检测试剂盒（R&D 分装）。
1.2 实验方法
1.2.1 药物准备 ①穿山龙：取穿山龙中药饮片300 g，水煎煮3次，过滤，合并滤液，文火蒸发水分，浓缩为100 mL，消毒后封瓶，4 ℃冰箱保存备用，实验时再加水稀释至所需浓度。②秋水仙碱乳悬液：取秋水仙碱片，研钵研细，电子天平称质量，用8 g/L 羧甲基纤维素钠（CMC Na）配成终浓度为80 mg/L的乳悬液。③ 尿酸钠晶体制备：在无菌条件下将1 mol/L的NaOH 6 mL和1 g尿酸钠加194 mL的高压后蒸馏水并煮沸，使尿酸钠完全溶解，搅拌，自然降温，滴入1 mol/L的HCl至pH值7.0，4 ℃冰箱保存24 h。弃上清，生理盐水洗涤沉淀3次，滤纸将沉淀物水分吸干后，置于70 ℃干燥箱烘2 h，将粉末研细，用孔径250 μm的金属筛过筛，装瓶备用。④尿酸钠溶液的制备：实验前将尿酸钠结晶置于180 ℃烤箱烘烤2 h，用体积分数0.95乙醇洗涤离心（4 250 r/min，15 min）3次，室温自然干燥，取500 mg尿酸钠结晶加9 mL生理盐水、1 mL吐温80加热搅拌，配制成50 g/L尿酸钠溶液10 mL。
1.2.2 实验分组及给药方法 将56只大鼠随机分为对照组、模型组、秋水仙碱组和穿山龙A组（15 g·kg-1·d-1）、B组（12 g·kg-1·d-1）、C组（6 g·kg-1·d-1）及D组（3 g·kg-1·d-1）。每组8只。穿山龙各剂量组于造模前2 d开始灌胃，每天1次，连续灌胃5 d。秋水仙碱组造模后开始给药，连续灌胃3 d。对照组和模型组造模后灌胃给等量的蒸馏水，连续3 d。
1.2.3 大鼠急性痛风性关节炎模型的建立 以碘附消毒大鼠右侧踝关节后，用6号注射针从背侧以45 ℃方向插入胫骨肌腱内侧，将50 μL的50 g/L尿酸钠溶液注入踝关节腔，伸曲、旋转运动5 min。对照组大鼠关节腔注入50 μL灭菌生理盐水。
1.2.4 观察指标及评价方法 观察指标包括大鼠精神状况，右踝关节同一部位的周径、肿胀情况、颜色、皮温及活动情况，并计算关节肿胀度。关节肿胀度计算：用3 mm宽纸条和游标卡尺测量实验前和造模后2、4、6、8、10、24、48和72 h右踝关节同一部位的周径，计算造模后与造模前右踝关节周径差值。
1.2.5 白细胞计数和血清IL 1β的检测 大鼠造模后72 h，用30 g/L戊巴比妥钠0.3 mL麻醉后心脏取血，1 mL入EDTA抗凝管，其余注入普通管。抗凝血用CELL DYN 1700细胞计数仪2 h内进行白细胞计数。非抗凝血37 ℃温育30 min，5 000 r/mim离心15 min，取上清置于-70 ℃冰箱冻存以备进行IL 1β检测。IL 1β检测采用ELISA法，严格按照试剂说明书进行操作。
1.3 统计学分析
采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示。各组均数间比较采用one way ANOVA分析，组间两两比较采用SNK检验。等级资料先转化为秩，再进行分析。
2 结 果
2.1 一般情况
入组大鼠56只，均进入结果分析，无脱失数值。造模后大鼠明显烦躁不安，右踝关节有明显的红、肿、热，且伴有功能障碍，活动受限。对照组无明显烦躁表现，关节与造模前相比略有增粗，无明显红、热及功能障碍的表现。
2.2 各组大鼠关节肿胀程度的比较
造模后各组大鼠关节均出现肿胀，且8～12 h达到高峰，其中以模型组最为明显。造模后2～72 h秋水仙碱组和穿山龙各剂量组大鼠关节肿胀程度与模型组相比，均有不同程度的下降，且穿山龙各剂量组下降幅度由低剂量向高剂量依次增加，穿山龙A组和B组关节肿胀程度明显低于模型组及秋水仙碱组，差异有显著性（F=4.359～37.568,q=7.84～32.34,P<0.05）。见表1。表1 各组大鼠造模后关节肿胀程度比较
2.3 各组大鼠白细胞计数及IL 1β比较
造模后72 h模型组、秋水仙碱组、穿山龙各剂量组大鼠白细胞计数及IL 1β均高于对照组,以模 型组最高，差异有显著意义（F=4.041、4.656，q=5.13～36.34,P<0.05）；穿山龙A组、B组和秋水仙碱组大鼠白细胞计数及IL 1β均低于模型组，差异有显著性（q=8.27～32.79,P<0.05）。见表2。表2 造模后72 h各组大鼠血浆白细胞计数与血清IL 1β的比较。
3 讨 论
急性痛风性关节炎是以关节及其周围组织的尿酸钠结晶沉积为特征。关节腔内尿酸钠结晶诱发急性炎症反应，引起中性粒细胞浸润、活化及一系列炎症因子的产生,从而导致组织破坏[2]。尿酸钠晶体被单核细胞吞噬后激活NALP3 炎性复合体(包括NALP3、ASC、Caspase 1),Caspase 1可将无活性的白细胞介素1（IL 1）转化有活性的IL 1β[3]。IL 1β是前炎症网络中的一级细胞因子，呈双峰状态[4]，作为炎症趋化因子和激活因子在痛风性关节炎的发生、发展过程中发挥关键作用[5,6]。关节腔内注入尿酸钠晶体制备急性痛风性关节炎病变模型，其病理表现与临床极为相似，为急性痛风性关节炎的经典造模方法，该法简单、造模迅速、成功率高。本文利用尿酸钠造模后大鼠关节出现红、肿、热和功能障碍等急性痛风性关节炎的表现，关节肿胀8～12 h达到高峰，该动物模型较充分地模拟了人类急性痛风性关节炎的发病过程[7,8]。本文结果显示，造模后各组血清IL 1β含量明显高于对照组，提示由尿酸钠晶体成功诱导急性痛风性关节炎模型[9,10]。
目前，治疗急性痛风发作的药物主要有秋水仙碱、NSAID、糖皮质激素等，秋水仙碱治疗痛风主要与其抑制中性粒细胞的迁移、抑制单核细胞吞噬尿酸盐结晶及吞噬后的炎症因子的分泌作用有关。但因其安全范围低，起效剂量与引发胃肠道不良反应剂量非常接近，不良反应报道极多。NSAID类药物治疗痛风时其抗炎作用主要是通过对COX 2的抑制，而绝大多数副作用尤其是胃肠道毒性多数病人不能耐受。应用糖皮质激素系统的初始化治疗急性痛风可引起关节炎红肿反弹。上述种种副作用使它们临床应用受到一定限制。
中药对痛风的治疗作用，目前引起人们的关注。本实验所用的穿山龙又称穿地龙、穿龙薯 ，属薯 科，多年生缠绕藤本，味苦，性平，归肝肺经。功效祛风除湿，活血通络，止咳平喘。主要用于风寒湿痹、肌肤麻木、筋骨疼痛、关节屈伸不利，以及跌打损伤、瘀滞作痛、冠心病、痰多咳喘等症，单用煎服或浸酒服。临床用于治疗急性痛风性关节炎屡获疗效。
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随着生活水平的提高,痛风的患病率不断增加。急性痛风性关节炎是痛风最常见的表现形式[1]。目前，治疗急性痛风发作的药物主要有非甾体消炎药（NSAID）、秋水仙碱、糖皮质激素等，但其药物不良反应多。中药治疗急性痛风性关节炎日益引起关注。本文建立大鼠急性痛风性关节炎模型，应用穿山龙进行治疗，观察其疗效。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠56只，10周龄，体质量（200±20）g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，实验前适应性喂养1周，饮食、饮水、活动正常，无不良反应即开始实验。整个实验过程中大鼠均自由摄食和饮水。
1.1.2 主要试剂 穿山龙中药饮片（毫州市凯利中药饮片有限公司生产），尿酸(Alfa Aesat)，秋水仙碱片（西双版纳版纳药业有限责任公司生产），吐温80（Sigma 分装，C283），大鼠白细胞介素1β（IL 1β）酶联免疫吸附反应检测试剂盒（R&D 分装）。
1.2 实验方法
1.2.1 药物准备 ①穿山龙：取穿山龙中药饮片300 g，水煎煮3次，过滤，合并滤液，文火蒸发水分，浓缩为100 mL，消毒后封瓶，4 ℃冰箱保存备用，实验时再加水稀释至所需浓度。②秋水仙碱乳悬液：取秋水仙碱片，研钵研细，电子天平称质量，用8 g/L 羧甲基纤维素钠（CMC Na）配成终浓度为80 mg/L的乳悬液。③ 尿酸钠晶体制备：在无菌条件下将1 mol/L的NaOH 6 mL和1 g尿酸钠加194 mL的高压后蒸馏水并煮沸，使尿酸钠完全溶解，搅拌，自然降温，滴入1 mol/L的HCl至pH值7.0，4 ℃冰箱保存24 h。弃上清，生理盐水洗涤沉淀3次，滤纸将沉淀物水分吸干后，置于70 ℃干燥箱烘2 h，将粉末研细，用孔径250 μm的金属筛过筛，装瓶备用。④尿酸钠溶液的制备：实验前将尿酸钠结晶置于180 ℃烤箱烘烤2 h，用体积分数0.95乙醇洗涤离心（4 250 r/min，15 min）3次，室温自然干燥，取500 mg尿酸钠结晶加9 mL生理盐水、1 mL吐温80加热搅拌，配制成50 g/L尿酸钠溶液10 mL。
1.2.2 实验分组及给药方法 将56只大鼠随机分为对照组、模型组、秋水仙碱组和穿山龙A组（15 g·kg-1·d-1）、B组（12 g·kg-1·d-1）、C组（6 g·kg-1·d-1）及D组（3 g·kg-1·d-1）。每组8只。穿山龙各剂量组于造模前2 d开始灌胃，每天1次，连续灌胃5 d。秋水仙碱组造模后开始给药，连续灌胃3 d。对照组和模型组造模后灌胃给等量的蒸馏水，连续3 d。
1.2.3 大鼠急性痛风性关节炎模型的建立 以碘附消毒大鼠右侧踝关节后，用6号注射针从背侧以45 ℃方向插入胫骨肌腱内侧，将50 μL的50 g/L尿酸钠溶液注入踝关节腔，伸曲、旋转运动5 min。对照组大鼠关节腔注入50 μL灭菌生理盐水。
1.2.4 观察指标及评价方法 观察指标包括大鼠精神状况，右踝关节同一部位的周径、肿胀情况、颜色、皮温及活动情况，并计算关节肿胀度。关节肿胀度计算：用3 mm宽纸条和游标卡尺测量实验前和造模后2、4、6、8、10、24、48和72 h右踝关节同一部位的周径，计算造模后与造模前右踝关节周径差值。
1.2.5 白细胞计数和血清IL 1β的检测 大鼠造模后72 h，用30 g/L戊巴比妥钠0.3 mL麻醉后心脏取血，1 mL入EDTA抗凝管，其余注入普通管。抗凝血用CELL DYN 1700细胞计数仪2 h内进行白细胞计数。非抗凝血37 ℃温育30 min，5 000 r/mim离心15 min，取上清置于-70 ℃冰箱冻存以备进行IL 1β检测。IL 1β检测采用ELISA法，严格按照试剂说明书进行操作。
1.3 统计学分析
采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示。各组均数间比较采用one way ANOVA分析，组间两两比较采用SNK检验。等级资料先转化为秩，再进行分析。
2 结 果
2.1 一般情况
入组大鼠56只，均进入结果分析，无脱失数值。造模后大鼠明显烦躁不安，右踝关节有明显的红、肿、热，且伴有功能障碍，活动受限。对照组无明显烦躁表现，关节与造模前相比略有增粗，无明显红、热及功能障碍的表现。
2.2 各组大鼠关节肿胀程度的比较
造模后各组大鼠关节均出现肿胀，且8～12 h达到高峰，其中以模型组最为明显。造模后2～72 h秋水仙碱组和穿山龙各剂量组大鼠关节肿胀程度与模型组相比，均有不同程度的下降，且穿山龙各剂量组下降幅度由低剂量向高剂量依次增加，穿山龙A组和B组关节肿胀程度明显低于模型组及秋水仙碱组，差异有显著性（F=4.359～37.568,q=7.84～32.34,P<0.05）。见表1。表1 各组大鼠造模后关节肿胀程度比较
2.3 各组大鼠白细胞计数及IL 1β比较
造模后72 h模型组、秋水仙碱组、穿山龙各剂量组大鼠白细胞计数及IL 1β均高于对照组,以模 型组最高，差异有显著意义（F=4.041、4.656，q=5.13～36.34,P<0.05）；穿山龙A组、B组和秋水仙碱组大鼠白细胞计数及IL 1β均低于模型组，差异有显著性（q=8.27～32.79,P<0.05）。见表2。表2 造模后72 h各组大鼠血浆白细胞计数与血清IL 1β的比较。
3 讨 论
急性痛风性关节炎是以关节及其周围组织的尿酸钠结晶沉积为特征。关节腔内尿酸钠结晶诱发急性炎症反应，引起中性粒细胞浸润、活化及一系列炎症因子的产生,从而导致组织破坏[2]。尿酸钠晶体被单核细胞吞噬后激活NALP3 炎性复合体(包括NALP3、ASC、Caspase 1),Caspase 1可将无活性的白细胞介素1（IL 1）转化有活性的IL 1β[3]。IL 1β是前炎症网络中的一级细胞因子，呈双峰状态[4]，作为炎症趋化因子和激活因子在痛风性关节炎的发生、发展过程中发挥关键作用[5,6]。关节腔内注入尿酸钠晶体制备急性痛风性关节炎病变模型，其病理表现与临床极为相似，为急性痛风性关节炎的经典造模方法，该法简单、造模迅速、成功率高。本文利用尿酸钠造模后大鼠关节出现红、肿、热和功能障碍等急性痛风性关节炎的表现，关节肿胀8～12 h达到高峰，该动物模型较充分地模拟了人类急性痛风性关节炎的发病过程[7,8]。本文结果显示，造模后各组血清IL 1β含量明显高于对照组，提示由尿酸钠晶体成功诱导急性痛风性关节炎模型[9,10]。
目前，治疗急性痛风发作的药物主要有秋水仙碱、NSAID、糖皮质激素等，秋水仙碱治疗痛风主要与其抑制中性粒细胞的迁移、抑制单核细胞吞噬尿酸盐结晶及吞噬后的炎症因子的分泌作用有关。但因其安全范围低，起效剂量与引发胃肠道不良反应剂量非常接近，不良反应报道极多。NSAID类药物治疗痛风时其抗炎作用主要是通过对COX 2的抑制，而绝大多数副作用尤其是胃肠道毒性多数病人不能耐受。应用糖皮质激素系统的初始化治疗急性痛风可引起关节炎红肿反弹。上述种种副作用使它们临床应用受到一定限制。
中药对痛风的治疗作用，目前引起人们的关注。本实验所用的穿山龙又称穿地龙、穿龙薯 ，属薯 科，多年生缠绕藤本，味苦，性平，归肝肺经。功效祛风除湿，活血通络，止咳平喘。主要用于风寒湿痹、肌肤麻木、筋骨疼痛、关节屈伸不利，以及跌打损伤、瘀滞作痛、冠心病、痰多咳喘等症，单用煎服或浸酒服。临床用于治疗急性痛风性关节炎屡获疗效。
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