临床防治CNV新方法探讨 文核心期刊要目总览
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内皮抑素是1997年由O’RELLY[1]等分离纯化获得的一种血管内皮细胞的强效抑制剂，能特异性抑制已经被激活的血管内皮细胞的增殖,阻断新生血管的生成。本文观察内皮抑素抑制兔眼角膜新生血管（CNV）形成的效果，为其用于治疗眼部新生血管性疾病及肿瘤奠定基础，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验动物为健康新西兰大白兔20只,雄兔11只，雌兔9只,体质量2.0～2. 5 kg,眼裂隙灯显微镜检查无眼病，青岛大学医学院实验动物中心提供。重组内皮抑素由我院中心实验室克隆和表达[2]，纯度92%, 用生理盐水稀释制成50 mg／L的溶液。所用仪器有：裂隙灯显微镜，数码照相机，计算机图像分析系统，眼科显微手术器材，CD34及免疫组化检测试剂盒（购自北京中山生物技术有限公司）。
1.2 实验方法
将20只大白兔随机分为实验组和对照组,每组10只(双眼)，均用苯巴比妥（30 mg／kg）自耳缘静脉注射行全麻,5 g/L丁卡因术前点眼行角膜局麻,在无菌条件下,用统一规格（直径3.0 mm）单层圆形滤纸浸入1 mol/L氢氧化钠溶液1 min, 达到饱和状态后取出，甩干多余液体,贴敷于角膜中央50 s,取下,立即用50 mL生理盐水冲洗角膜及结膜囊,回笼后正常饲养。角膜碱烧伤后第1天起，实验组球结膜下注射重组人内皮抑素0.05 mL,对照组球结膜下注射生理盐水0.05 mL，均隔日1次，共19 d。
每天滴氯霉素滴眼液（润舒）6 次，夜晚涂红霉素眼膏1次。
1.3 CNV检测
每日裂隙灯显微镜下（放大8倍）观察，测量自角膜缘长出的CNV长度和数量,并摄影，输入计算机经图像分析系统计算CNV 面积（A）。
1.4 微血管密度（MVD）检测
碱烧伤后第19天，各组兔子均用空气栓塞法处死,取角膜，石蜡包埋、切片，行苏木精 伊红染色及CD34免疫组化染色。CD34染色以血管内皮细胞胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒为阳性判断标准。在低倍镜下（100倍）选取角膜血管内皮细胞染色清晰，背景对照良好的5个视野，然后在高倍镜下（400倍）计数所有染色的微血管数，取其平均值作为该切片的MVD。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理, 结果以±s表示,数据间比较采用t检验。
2 结果
2.1 两组CNV比较
碱烧伤后最初3 d,两组结膜均表现为混合充血,烧伤区角膜呈灰白色水肿,第4天两组CNV开始长入角膜缘内, 实验组与对照组CNV 生长情况无明显差异。术后7～14 d，对照组CNV生长最为旺盛,血管粗密, 面积为(8.48±1.03)～ (23.91±1.82) mm2；实验组CNV细小、稀疏、生长缓慢,面积为(5.67±0.61)～ (17.71±1.65)mm2。两组术后7～14 d CNV生长面积比较，差异有显著性(t=7.443、8.003，P<0.01)。见表1。术后15～16 d两组血管生长减慢，开始消退，但19 d两组CNV面积比较，差异仍有显著性（t=6.639,P<0.01）。 表1 两组兔角膜碱烧伤后不同时间CNV面积比较
2.2 两组MVD比较
苏木精 伊红染色显示，对照组角膜全基质内可见大量新生血管，管壁薄，管腔大，排列紊乱；实验组浅基质层内可见较少量新生毛细血管，且管腔较小，分布较稀疏。免疫组化染色示，CD34在血管内皮细胞胞浆及胞膜表达，对照组血管多，管腔大，黄染区多，MVD为5.87±1.44；实验组CNV 稀少,管腔细,黄染区少，MVD为3.60±0.94。两组MVD比较，差异有显著性（t= 4.191，P<0.05）。
3 讨 论
内皮抑素是近几年发现的血管生成抑制剂。DHANABAL等[4]研究显示,内皮抑素能特异性抑制处于增殖状态的新生血管内皮细胞,并伴有诱导凋亡的作用。近年来,国内外学者对内皮抑素的研究主要集中在其对肿瘤的治疗作用。动物实验显示，内皮抑素能够阻断肿瘤细胞的血液供应， 使肿瘤消退，用于肿瘤治疗取得了良好的效果。
各种病因，如配戴角膜接触镜、角膜创伤、手术、感染等导致的CNV增生是致盲的重要原因之一， 亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素， 但在临床上对于CNV的治疗至今还是一个极为棘手的问题。CNV是由角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成，与血管内皮细胞的增殖密切相关，因此，对CNV抑制性药物进行研究，对于CNV的防治、保持角膜透明性、恢复视力有着重要意义。CNV性疾病将是应用内皮抑素进行治疗的一个良好适应证。
本文实验采用碱烧伤法诱导CNV的形成，该模型非常逼真地再现了角膜碱烧伤的病理状态，是研究炎症性新生血管发生机制和治疗的重要手段，且此模型操作简便，便于观察和比较新生血管生长状况。我们将重组内皮抑素用于治疗碱烧伤法诱导的角膜CNV,观察其抑制CNV的效果。结果显示，重组内皮抑素可明显抑制CNV的增生。
本文观察了不同时间CNV生长情况,发现碱烧伤后7～14 d为血管生长最旺盛时期。内皮抑素能够明显抑制CNV的增生，主要表现为CNV生长速度减慢，生长面积较小。本文实验组CNV面积明显低于对照组，MVD也明显低于对照组， 差异有统计学意义。
目前,有关内皮抑素抑制新生血管形成的机制还不很清楚。RAPRAEGER等[8]研究表明,内皮抑素可通过与内皮细胞表面硫酸肝素糖蛋白结合,抑制促血管生成因子VEGF 和FGF2与内皮细胞的结合,从而干扰细胞黏附、迁移。此外,有关内皮抑素抑制内皮细胞的迁移机制包括：①内皮抑素与原肌球蛋白结合破坏微丝结构的完整性,从而导致细胞运动功能丧失; ②与抑制基质外金属蛋白酶有关,基质外金属蛋白酶是一种含锌结构的内源性多肽,在新生血管的形成中起重要作用,它可以选择性地降解细胞外基质,这是新生血管生成开始阶段细胞侵入和迁移所必需的,内皮抑素与基质外金属蛋白酶酶原结合抑制该酶的激活。
本文实验结果显示，内皮抑素并不能完全抑制CNV的增长，说明CNV的发生是一个复杂的、由多种因子共同调节的过程, 单一因子可能并不能完全抑制其生长。实验过程中实验组与对照组结膜充血程度、角膜反应相似,角膜水肿的消退过程基本一致,证明内皮抑素在眼部应用是安全的,不影响碱烧伤后角膜的愈合过程。
核心期刊要目总览2012 www.qikanba.com
内皮抑素是1997年由O’RELLY[1]等分离纯化获得的一种血管内皮细胞的强效抑制剂，能特异性抑制已经被激活的血管内皮细胞的增殖,阻断新生血管的生成。本文观察内皮抑素抑制兔眼角膜新生血管（CNV）形成的效果，为其用于治疗眼部新生血管性疾病及肿瘤奠定基础，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验动物为健康新西兰大白兔20只,雄兔11只，雌兔9只,体质量2.0～2. 5 kg,眼裂隙灯显微镜检查无眼病，青岛大学医学院实验动物中心提供。重组内皮抑素由我院中心实验室克隆和表达[2]，纯度92%, 用生理盐水稀释制成50 mg／L的溶液。所用仪器有：裂隙灯显微镜，数码照相机，计算机图像分析系统，眼科显微手术器材，CD34及免疫组化检测试剂盒（购自北京中山生物技术有限公司）。
1.2 实验方法
将20只大白兔随机分为实验组和对照组,每组10只(双眼)，均用苯巴比妥（30 mg／kg）自耳缘静脉注射行全麻,5 g/L丁卡因术前点眼行角膜局麻,在无菌条件下,用统一规格（直径3.0 mm）单层圆形滤纸浸入1 mol/L氢氧化钠溶液1 min, 达到饱和状态后取出，甩干多余液体,贴敷于角膜中央50 s,取下,立即用50 mL生理盐水冲洗角膜及结膜囊,回笼后正常饲养。角膜碱烧伤后第1天起，实验组球结膜下注射重组人内皮抑素0.05 mL,对照组球结膜下注射生理盐水0.05 mL，均隔日1次，共19 d。
每天滴氯霉素滴眼液（润舒）6 次，夜晚涂红霉素眼膏1次。
1.3 CNV检测
每日裂隙灯显微镜下（放大8倍）观察，测量自角膜缘长出的CNV长度和数量,并摄影，输入计算机经图像分析系统计算CNV 面积（A）。
1.4 微血管密度（MVD）检测
碱烧伤后第19天，各组兔子均用空气栓塞法处死,取角膜，石蜡包埋、切片，行苏木精 伊红染色及CD34免疫组化染色。CD34染色以血管内皮细胞胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒为阳性判断标准。在低倍镜下（100倍）选取角膜血管内皮细胞染色清晰，背景对照良好的5个视野，然后在高倍镜下（400倍）计数所有染色的微血管数，取其平均值作为该切片的MVD。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理, 结果以±s表示,数据间比较采用t检验。
2 结果
2.1 两组CNV比较
碱烧伤后最初3 d,两组结膜均表现为混合充血,烧伤区角膜呈灰白色水肿,第4天两组CNV开始长入角膜缘内, 实验组与对照组CNV 生长情况无明显差异。术后7～14 d，对照组CNV生长最为旺盛,血管粗密, 面积为(8.48±1.03)～ (23.91±1.82) mm2；实验组CNV细小、稀疏、生长缓慢,面积为(5.67±0.61)～ (17.71±1.65)mm2。两组术后7～14 d CNV生长面积比较，差异有显著性(t=7.443、8.003，P<0.01)。见表1。术后15～16 d两组血管生长减慢，开始消退，但19 d两组CNV面积比较，差异仍有显著性（t=6.639,P<0.01）。 表1 两组兔角膜碱烧伤后不同时间CNV面积比较
2.2 两组MVD比较
苏木精 伊红染色显示，对照组角膜全基质内可见大量新生血管，管壁薄，管腔大，排列紊乱；实验组浅基质层内可见较少量新生毛细血管，且管腔较小，分布较稀疏。免疫组化染色示，CD34在血管内皮细胞胞浆及胞膜表达，对照组血管多，管腔大，黄染区多，MVD为5.87±1.44；实验组CNV 稀少,管腔细,黄染区少，MVD为3.60±0.94。两组MVD比较，差异有显著性（t= 4.191，P<0.05）。
3 讨 论
内皮抑素是近几年发现的血管生成抑制剂。DHANABAL等[4]研究显示,内皮抑素能特异性抑制处于增殖状态的新生血管内皮细胞,并伴有诱导凋亡的作用。近年来,国内外学者对内皮抑素的研究主要集中在其对肿瘤的治疗作用。动物实验显示，内皮抑素能够阻断肿瘤细胞的血液供应， 使肿瘤消退，用于肿瘤治疗取得了良好的效果。
各种病因，如配戴角膜接触镜、角膜创伤、手术、感染等导致的CNV增生是致盲的重要原因之一， 亦是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素， 但在临床上对于CNV的治疗至今还是一个极为棘手的问题。CNV是由角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成，与血管内皮细胞的增殖密切相关，因此，对CNV抑制性药物进行研究，对于CNV的防治、保持角膜透明性、恢复视力有着重要意义。CNV性疾病将是应用内皮抑素进行治疗的一个良好适应证。
本文实验采用碱烧伤法诱导CNV的形成，该模型非常逼真地再现了角膜碱烧伤的病理状态，是研究炎症性新生血管发生机制和治疗的重要手段，且此模型操作简便，便于观察和比较新生血管生长状况。我们将重组内皮抑素用于治疗碱烧伤法诱导的角膜CNV,观察其抑制CNV的效果。结果显示，重组内皮抑素可明显抑制CNV的增生。
本文观察了不同时间CNV生长情况,发现碱烧伤后7～14 d为血管生长最旺盛时期。内皮抑素能够明显抑制CNV的增生，主要表现为CNV生长速度减慢，生长面积较小。本文实验组CNV面积明显低于对照组，MVD也明显低于对照组， 差异有统计学意义。
目前,有关内皮抑素抑制新生血管形成的机制还不很清楚。RAPRAEGER等[8]研究表明,内皮抑素可通过与内皮细胞表面硫酸肝素糖蛋白结合,抑制促血管生成因子VEGF 和FGF2与内皮细胞的结合,从而干扰细胞黏附、迁移。此外,有关内皮抑素抑制内皮细胞的迁移机制包括：①内皮抑素与原肌球蛋白结合破坏微丝结构的完整性,从而导致细胞运动功能丧失; ②与抑制基质外金属蛋白酶有关,基质外金属蛋白酶是一种含锌结构的内源性多肽,在新生血管的形成中起重要作用,它可以选择性地降解细胞外基质,这是新生血管生成开始阶段细胞侵入和迁移所必需的,内皮抑素与基质外金属蛋白酶酶原结合抑制该酶的激活。
本文实验结果显示，内皮抑素并不能完全抑制CNV的增长，说明CNV的发生是一个复杂的、由多种因子共同调节的过程, 单一因子可能并不能完全抑制其生长。实验过程中实验组与对照组结膜充血程度、角膜反应相似,角膜水肿的消退过程基本一致,证明内皮抑素在眼部应用是安全的,不影响碱烧伤后角膜的愈合过程。
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