Ghrelin在2型糖尿病大鼠血清和胃组织中的运用 护理杂志的核心期刊
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糖尿病胃轻瘫是糖尿病常见的并发症，其发病率高达30%～50%。其典型临床表现为恶心、呕吐、早饱、腹胀、腹痛、食欲不振等症状，产生上述症状主要和胃动力障碍有关。研究发现，Ghrelin具有调节能量平衡和促进胃肠运动等多种生物学作用。本研究以2型糖尿病大鼠模型为研究对象，观察Ghrelin在2型糖尿病大鼠血清和胃组织中的表达情况及其与胃排空延迟的关系。
1 材料和方法
1.1 大鼠糖尿病模型的建立和分组
SPF级雄性Wistar大鼠30只（购自青岛市动物实验中心），8周龄，体质量约180 g，适应性喂养1周后随机分成糖尿病组、单纯肥胖组和对照组，每组10只。糖尿病组和单纯肥胖组大鼠喂以高糖高脂饲料（猪油10%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸钠1%，常规饲料66.5%），饮用120 g/L果糖水[1]。对照组喂以常规饲料，饮用自来水。大鼠在高糖高脂饮食8周后，测定体质量、血糖及胰岛素水平，单纯肥胖组出现体质量增加及胰岛素抵抗者为模型成功（10只）。糖尿病组禁食不禁水12 h，腹腔一次性注射30 mg/kg STZ（Sigma公司），单纯肥胖组及对照组腹腔注入同等体积的枸橼酸缓冲液，注射48 h后测定血糖及胰岛素水平，血糖≥16.7 mmol/ L 并伴有胰岛素抵抗者为2型糖尿病模型成功（8只）。在整个造模及分组的过程中，大鼠每周及处死当天测定空腹血糖，同时测量体质量，观察大鼠一般情况。
1.2 胃排空的测定
造模成功后，在大鼠禁食不禁水16 h后，给予1.5 mmol/L的酚红溶液2 mL灌胃,15 min后处死大鼠，剖腹，结扎贲门和幽门，取出整个鼠胃，沿胃大弯切开，以蒸馏水冲洗胃内容物，定容为20 mL，然后加入0.5 mol/L NaOH 20 mL搅拌混匀，静置1 h，取5 mL上清液加入200 g/L三氯乙酸0.5 mL去蛋白，以3 500 r/min(离心半径10 cm)离心10 min, 取上清液用分光光度计在560 nm 波长处测定吸光度值。另取酚红溶液2 mL，先后加入蒸馏水18 mL、0.5 mol/L NaOH 20 mL、200 g/L三氯乙酸4 mL搅拌混匀，测定吸光度值。大鼠胃排空率=(1-实测酚红吸光度/标准酚红吸光度)×100%[2]。
1.3 血清Ghrelin的测定
根据Ghrelin酶联免疫试剂盒说明，利用生物素标记肽与样本中待测肽类竞争性结合抗体的原理，检测450 nm波长处吸光度，并计算出结果。
1.4 荧光RT PCR检测胃组织Ghrelin表达
用Trizol试剂提取胃组织总RNA，以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，并进行核酸的纯度和浓度分析，逆转录合成cDNA,根据GenBank中的相应序列设计合成目的片段和内参照引物。以GAPDH为内参照物，其上游引物为5′ TTCTAGA GACAGCCGCATCT 3′，下游引物为5′ TGGTAA CCAGGTGTCCGATA 3′，产物长度为106 bp；Ghrelin目的片段上游引物为5′ CAGAGCACCAGAAAGC CCAGCAG 3′，下游引物为5′ CCAACATCGAAGG GAGCATTGAA 3′，产物长度为160 bp。根据SYBRGreen染料法（Takara试剂盒，大连宝生物有限公司）进行荧光定量PCR。反应结束后，取扩增产物4 μL，用16 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果，电泳图见特异性条带。
分析DNA扩增曲线，利用专用数据处理软件得出数据并进行误差分析。采用2-△△ct法进行定量分析。ct值为荧光信号显著增长时的循环次数，△ct=样品的ct均值-内参照的ct均值,△△ct=△ct-（随机对照组样品的ct均值-内参照的ct均值），然后取2-△△ct即代表某样品其初始cDNA的相对量[3]。
1.5 统计学分析
所有计量资料均以±s表示，用SPSS 11.5及PPMS 1.5[4]统计软件进行单因素方差分析和两两比较q检验。
2 结果
2.1 一般情况
8周末对照组大鼠毛发光泽，体态匀称；单纯肥胖组大鼠安静，不喜动，饮食量及饮水量明显增加，解剖发现皮下、腹内脂肪堆积，腹内肠胀气，体型粗短，呈向心性肥胖；糖尿病组大鼠STZ注射48 h后出现精神萎靡。高糖高脂饮食8周后，糖尿病组和单纯肥胖组大鼠体质量较对照组均显著增加(F=63.90，q=12.76～14.51，P<0.05)；糖尿病组和单纯肥胖组之间差异无显著性（P>0.05）。见表1。
2.2 血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数
高糖高脂饮食8周后，单纯肥胖组和糖尿病组胰岛素水平较对照组均显著升高（F=16.72,q=7.32、6.67，P<0.05）；胰岛素抵抗指数（空腹血糖与空腹胰岛素乘积除以22.5）较对照组均显著增高(F=46.87，q=13.63、5.33，P<0.05)；血糖有所增高，但与对照组比较差异无显著性（F=0.54,P>0.05）。糖尿病组和单纯肥胖组血糖、胰岛素水平差异均无显著性（P>0.05）。见表1。
注射STZ或枸橼酸缓冲液后，糖尿病组大鼠胰岛素水平下降，与单纯肥胖组比较差异有显著意义（F=22.73, q=7.14，P<0.05），与对照组比较差异无显著性（q=1.28，P>0.05）;血糖水平升高达到糖尿病诊断标准，与对照组及单纯肥胖组比较差异有显著意义（F=129.00,q=20.50、19.58，P<0.05）。单纯肥胖组与对照组比较血糖水平差异无显著性（q=0.99，P>0.05），胰岛素水平差异有显著性（q=8.94，P<0.05）。
2.3 胃排空、血清Ghrelin水平及胃组织Ghrelin mRNA表达
8周末单纯肥胖组大鼠的液体胃排空率低于对照组（F=123.00, q=19.49，P<0.05），血清Ghrelin及胃组织Ghrelin mRNA表达较对照组明显下降(F=35.01、34.69, q=11.16、10.02，P<0.05)。 注射STZ后糖尿病组大鼠的液体胃排空率低于对照组（q=18.52，P<0.05），血清Ghrelin水平及胃组织Ghrelin mRNA表达较对照组均明显下降(q=8.73、 10.18，P<0.05)。见表2。标本荧光定量扩 表1 注射STZ前后各组大鼠体质量、血糖及血清胰岛素水平表2 各组大鼠胃排空、血清Ghrelin水平以及胃组织Ghrelin mRNA表达的比较
3 讨 论
本实验通过高糖高脂饮食诱导高胰岛素血症和胰岛素抵抗，制备单纯肥胖大鼠，再通过注射亚致病剂量STZ破坏胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍，最后诱导出高糖血症。目前多采用此方法制备2型糖尿病模型[1]。
Ghrelin是近年来发现的一种由28个氨基酸残基组成的脑肠肽激素，主要由胃底部黏膜泌酸腺X/A细胞合成并分泌入血，其氨基酸序列与胃动素相似，且受体之间也有50%的同源性，Ghrelin第3位的丝氨酸辛酰化是主要活性形式，可以自由通过血 脑脊液屏障，通过与其受体结合发挥出和胃动素类似的加速胃排空的作用，因此Ghrelin也称胃动素相关肽[5]。MASUDA等［6］研究显示，大鼠静脉注射Ghrelin 10 min后胃运动幅度达到最大,胃排空加快。而人体试验表明，静脉给予Ghrelin可明显加快自发性胃轻瘫及糖尿病胃轻瘫病人的胃排空,使腹胀等症状得到改善［7］。
由于Ghrelin的受体即生长激素促分泌素受体（GHSR)不仅分布在中枢，而且在大部分外周组织中也有分布。原位杂交研究显示，GHSR主要存在于下丘脑弓状核[8]，在人和大鼠胃、结肠组织神经元胞体和纤维、胃腺相关细胞、公认的肠内分泌细胞和（或）肥大细胞中及大鼠肌肉相关神经纤维上也有GHSR免疫反应性，同时有研究表明，GHSR存在于迷走传入神经元和肠壁及肠肌丛神经元上。
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糖尿病胃轻瘫是糖尿病常见的并发症，其发病率高达30%～50%。其典型临床表现为恶心、呕吐、早饱、腹胀、腹痛、食欲不振等症状，产生上述症状主要和胃动力障碍有关。研究发现，Ghrelin具有调节能量平衡和促进胃肠运动等多种生物学作用。本研究以2型糖尿病大鼠模型为研究对象，观察Ghrelin在2型糖尿病大鼠血清和胃组织中的表达情况及其与胃排空延迟的关系。
1 材料和方法
1.1 大鼠糖尿病模型的建立和分组
SPF级雄性Wistar大鼠30只（购自青岛市动物实验中心），8周龄，体质量约180 g，适应性喂养1周后随机分成糖尿病组、单纯肥胖组和对照组，每组10只。糖尿病组和单纯肥胖组大鼠喂以高糖高脂饲料（猪油10%，蔗糖20%，胆固醇2.5%，胆酸钠1%，常规饲料66.5%），饮用120 g/L果糖水[1]。对照组喂以常规饲料，饮用自来水。大鼠在高糖高脂饮食8周后，测定体质量、血糖及胰岛素水平，单纯肥胖组出现体质量增加及胰岛素抵抗者为模型成功（10只）。糖尿病组禁食不禁水12 h，腹腔一次性注射30 mg/kg STZ（Sigma公司），单纯肥胖组及对照组腹腔注入同等体积的枸橼酸缓冲液，注射48 h后测定血糖及胰岛素水平，血糖≥16.7 mmol/ L 并伴有胰岛素抵抗者为2型糖尿病模型成功（8只）。在整个造模及分组的过程中，大鼠每周及处死当天测定空腹血糖，同时测量体质量，观察大鼠一般情况。
1.2 胃排空的测定
造模成功后，在大鼠禁食不禁水16 h后，给予1.5 mmol/L的酚红溶液2 mL灌胃,15 min后处死大鼠，剖腹，结扎贲门和幽门，取出整个鼠胃，沿胃大弯切开，以蒸馏水冲洗胃内容物，定容为20 mL，然后加入0.5 mol/L NaOH 20 mL搅拌混匀，静置1 h，取5 mL上清液加入200 g/L三氯乙酸0.5 mL去蛋白，以3 500 r/min(离心半径10 cm)离心10 min, 取上清液用分光光度计在560 nm 波长处测定吸光度值。另取酚红溶液2 mL，先后加入蒸馏水18 mL、0.5 mol/L NaOH 20 mL、200 g/L三氯乙酸4 mL搅拌混匀，测定吸光度值。大鼠胃排空率=(1-实测酚红吸光度/标准酚红吸光度)×100%[2]。
1.3 血清Ghrelin的测定
根据Ghrelin酶联免疫试剂盒说明，利用生物素标记肽与样本中待测肽类竞争性结合抗体的原理，检测450 nm波长处吸光度，并计算出结果。
1.4 荧光RT PCR检测胃组织Ghrelin表达
用Trizol试剂提取胃组织总RNA，以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，并进行核酸的纯度和浓度分析，逆转录合成cDNA,根据GenBank中的相应序列设计合成目的片段和内参照引物。以GAPDH为内参照物，其上游引物为5′ TTCTAGA GACAGCCGCATCT 3′，下游引物为5′ TGGTAA CCAGGTGTCCGATA 3′，产物长度为106 bp；Ghrelin目的片段上游引物为5′ CAGAGCACCAGAAAGC CCAGCAG 3′，下游引物为5′ CCAACATCGAAGG GAGCATTGAA 3′，产物长度为160 bp。根据SYBRGreen染料法（Takara试剂盒，大连宝生物有限公司）进行荧光定量PCR。反应结束后，取扩增产物4 μL，用16 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线灯下观察结果，电泳图见特异性条带。
分析DNA扩增曲线，利用专用数据处理软件得出数据并进行误差分析。采用2-△△ct法进行定量分析。ct值为荧光信号显著增长时的循环次数，△ct=样品的ct均值-内参照的ct均值,△△ct=△ct-（随机对照组样品的ct均值-内参照的ct均值），然后取2-△△ct即代表某样品其初始cDNA的相对量[3]。
1.5 统计学分析
所有计量资料均以±s表示，用SPSS 11.5及PPMS 1.5[4]统计软件进行单因素方差分析和两两比较q检验。
2 结果
2.1 一般情况
8周末对照组大鼠毛发光泽，体态匀称；单纯肥胖组大鼠安静，不喜动，饮食量及饮水量明显增加，解剖发现皮下、腹内脂肪堆积，腹内肠胀气，体型粗短，呈向心性肥胖；糖尿病组大鼠STZ注射48 h后出现精神萎靡。高糖高脂饮食8周后，糖尿病组和单纯肥胖组大鼠体质量较对照组均显著增加(F=63.90，q=12.76～14.51，P<0.05)；糖尿病组和单纯肥胖组之间差异无显著性（P>0.05）。见表1。
2.2 血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数
高糖高脂饮食8周后，单纯肥胖组和糖尿病组胰岛素水平较对照组均显著升高（F=16.72,q=7.32、6.67，P<0.05）；胰岛素抵抗指数（空腹血糖与空腹胰岛素乘积除以22.5）较对照组均显著增高(F=46.87，q=13.63、5.33，P<0.05)；血糖有所增高，但与对照组比较差异无显著性（F=0.54,P>0.05）。糖尿病组和单纯肥胖组血糖、胰岛素水平差异均无显著性（P>0.05）。见表1。
注射STZ或枸橼酸缓冲液后，糖尿病组大鼠胰岛素水平下降，与单纯肥胖组比较差异有显著意义（F=22.73, q=7.14，P<0.05），与对照组比较差异无显著性（q=1.28，P>0.05）;血糖水平升高达到糖尿病诊断标准，与对照组及单纯肥胖组比较差异有显著意义（F=129.00,q=20.50、19.58，P<0.05）。单纯肥胖组与对照组比较血糖水平差异无显著性（q=0.99，P>0.05），胰岛素水平差异有显著性（q=8.94，P<0.05）。
2.3 胃排空、血清Ghrelin水平及胃组织Ghrelin mRNA表达
8周末单纯肥胖组大鼠的液体胃排空率低于对照组（F=123.00, q=19.49，P<0.05），血清Ghrelin及胃组织Ghrelin mRNA表达较对照组明显下降(F=35.01、34.69, q=11.16、10.02，P<0.05)。 注射STZ后糖尿病组大鼠的液体胃排空率低于对照组（q=18.52，P<0.05），血清Ghrelin水平及胃组织Ghrelin mRNA表达较对照组均明显下降(q=8.73、 10.18，P<0.05)。见表2。标本荧光定量扩 表1 注射STZ前后各组大鼠体质量、血糖及血清胰岛素水平表2 各组大鼠胃排空、血清Ghrelin水平以及胃组织Ghrelin mRNA表达的比较
3 讨 论
本实验通过高糖高脂饮食诱导高胰岛素血症和胰岛素抵抗，制备单纯肥胖大鼠，再通过注射亚致病剂量STZ破坏胰腺功能，导致胰腺代偿性分泌胰岛素的功能障碍，最后诱导出高糖血症。目前多采用此方法制备2型糖尿病模型[1]。
Ghrelin是近年来发现的一种由28个氨基酸残基组成的脑肠肽激素，主要由胃底部黏膜泌酸腺X/A细胞合成并分泌入血，其氨基酸序列与胃动素相似，且受体之间也有50%的同源性，Ghrelin第3位的丝氨酸辛酰化是主要活性形式，可以自由通过血 脑脊液屏障，通过与其受体结合发挥出和胃动素类似的加速胃排空的作用，因此Ghrelin也称胃动素相关肽[5]。MASUDA等［6］研究显示，大鼠静脉注射Ghrelin 10 min后胃运动幅度达到最大,胃排空加快。而人体试验表明，静脉给予Ghrelin可明显加快自发性胃轻瘫及糖尿病胃轻瘫病人的胃排空,使腹胀等症状得到改善［7］。
由于Ghrelin的受体即生长激素促分泌素受体（GHSR)不仅分布在中枢，而且在大部分外周组织中也有分布。原位杂交研究显示，GHSR主要存在于下丘脑弓状核[8]，在人和大鼠胃、结肠组织神经元胞体和纤维、胃腺相关细胞、公认的肠内分泌细胞和（或）肥大细胞中及大鼠肌肉相关神经纤维上也有GHSR免疫反应性，同时有研究表明，GHSR存在于迷走传入神经元和肠壁及肠肌丛神经元上。
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