香菇抑制多种肿瘤细胞生长的作用机制研究-中医护理论文
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1 材料与方法
1.1 材料香菇C91-3菌种由大连医科大学微生物实验室保存。Chroma Spin+TE-1000购自CLONTECH公司。克隆载体pBlueScript II SK（+），pMD19-T；宿主细菌E.coil DH10B，E.coil DH5；RNAiso plus，Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit ，cDNA Library Construction Kit， Ex Taq Hot Start Version，修饰酶，DNA marker等试剂以及PCR引物均来自TaKaRa大连公司。氨苄青霉素，X-Gal，IPTG，琼脂糖，胰化蛋白胨，酵母提取物购自大连晨钰生物试剂公司。其它试剂由大连医科大学提供。
1.2 RNA提取及来源检验香菇C91-3发酵液100ml无菌纱布过滤除渣后，低速离心集菌。沉淀研磨后加入TaKaRa RNAiso plus 10ml，继续研磨至溶液透明，加入2ml氯仿抽提。加入预冷的无水乙醇，高速离心后DEPC处理水溶解沉淀。根据香菇5SrRNA基因间非转录间隔区2（IGR2）序列（GI：5688862），设计巢式PCR引物。1-上游引物：5'-ACA TGA CCA AAC AAA CCC CT-3‘，1-下游引物5'-CTA AGC CCA AGC AAC CAC TG-3’；2-上游引物：5'-ATC TAG CTC GTT GAA GGG GA-3‘，2-下游引物5'-CTT GAC AAT GCG TTC TAC CG-3’；使用Ex Taq HS酶扩增（ 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）。PCR产物与pMD19-T载体连接后测序。总RNA溶液中加入等体积的Oligotex-dT30 mRNA Purification Binding Buffer（2×），按TaKaRa操作手册纯化mRNA。
1.3 cDNA合成5 μg mRNA为模板，按照TaKaRa cDNA Library Construction Kit操作手册进行反转录反应，合成的双链cDNA的3‘端含有XhoI酶切位点。双链cDNA两端连接EcoRI Adaptor后，XhoI酶切。反应体系移入Chroma Spin+TE-1000 Column中，700 g离心5 min，收集管中即为大于400bp的双链cDNA。
1.4 连接质粒载体质粒pBlueScriptII SK（+）进行EcoRI/XhoI双酶切。60 μl纯化的cDNA中加入200 ng开链pBlueScriptII SK（+），2 800 U T4 DNA Ligase，12℃过夜连接。连接产物回收，溶于20 μl TE。
1.5 cDNA文库鉴定取0.5 μl重组质粒1∶10稀释，预冷的0.1 cm冲击槽加入1 μl稀释液及100 μl E.coil DH10B进行电转化，冲击条件1.5 kV，200 Ω，25 μF；冰上加入预冷的SOC培养基1 ml，全量回收后37℃振荡培养1 h。分别取1 μl培养液1∶100，1∶200，1∶500稀释，10 μl稀释液涂布于LB琼脂糖筛选平板（含X-Gal 20 μg/ml，IPTG 24 mg/ml，Amp 100 μg/ml），37℃过夜培养。计算初始文库库容。取5 μl未稀释的培养物涂布于LB/Amp平板，37过夜培养后，加入LB/Amp液体培养基2 ml洗脱菌落并回收，计算初级文库滴度。
1.6 PCR检测插入片段随机挑取15个白色菌落，SOC/Amp培养基37℃过夜培养后，碱裂解法提取质粒，使用T7、T3引物进行PCR扩增。T7 引物：5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；T3引物：5'- ATTAACCCTCACTAAAGGGAA -3‘；PCR条件：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min。
2 结果
香菇作为一种常用的药用真菌在预防、治疗恶性肿瘤方面都具有重要价值，其多糖提取物主要为β-1,3键连接主链和β-1,6键连接支链的葡聚糖，能够提高机体免疫功能，间接抑制肿瘤的生长［1，2］，具有突出防癌抗癌、提高免疫力及缓解化疗反应等作用［3，4］，现已正式被作为辅助化疗药物应用于临床，香菇也被我国列为抗癌资源植物［5］。
香菇C91-3发酵液蛋白提取物能够抑制多种肿瘤细胞生长，大大延长荷瘤动物的生存期并且显着改善其生存状态。目前关于香菇C91-3发酵液中抗肿瘤效应蛋白的研究已经取得阶段性成果，本研究以香菇C91-3发酵液为RNA来源构建cDNA文库，以便进行分子生物学水平的后续研究。
本实验的RNA来源为香菇C91-3发酵液，为排除杂菌污染，作5SrRNA保守区段的PCR鉴定，扩增得到的5SrRNA IGR2片段与NCBI数据库中记录的香菇L54菌株吻合。距离树分析显示已知的担子菌类真菌5SrRNA IGR2变异较大，毒伞蕈与扩增片段的一致性为79%，松口蘑为78%，双色蜡蘑为77%。可见，香菇与这3种担子菌在进化上有一定差异。在模板及插入片段的制备过程中，经过多次纯化，大大降低了基因组DNA及cDNA短片段的影响，因此，本文库质量较高，初始库容达到7.2×106 cfu以上，即使是单拷贝基因也可以在本文库中找到，完全符合筛选文库要求。
社区护理论文发表 http://www.qikanba.com/
1 材料与方法
1.1 材料香菇C91-3菌种由大连医科大学微生物实验室保存。Chroma Spin+TE-1000购自CLONTECH公司。克隆载体pBlueScript II SK（+），pMD19-T；宿主细菌E.coil DH10B，E.coil DH5；RNAiso plus，Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit ，cDNA Library Construction Kit， Ex Taq Hot Start Version，修饰酶，DNA marker等试剂以及PCR引物均来自TaKaRa大连公司。氨苄青霉素，X-Gal，IPTG，琼脂糖，胰化蛋白胨，酵母提取物购自大连晨钰生物试剂公司。其它试剂由大连医科大学提供。
1.2 RNA提取及来源检验香菇C91-3发酵液100ml无菌纱布过滤除渣后，低速离心集菌。沉淀研磨后加入TaKaRa RNAiso plus 10ml，继续研磨至溶液透明，加入2ml氯仿抽提。加入预冷的无水乙醇，高速离心后DEPC处理水溶解沉淀。根据香菇5SrRNA基因间非转录间隔区2（IGR2）序列（GI：5688862），设计巢式PCR引物。1-上游引物：5'-ACA TGA CCA AAC AAA CCC CT-3‘，1-下游引物5'-CTA AGC CCA AGC AAC CAC TG-3’；2-上游引物：5'-ATC TAG CTC GTT GAA GGG GA-3‘，2-下游引物5'-CTT GAC AAT GCG TTC TAC CG-3’；使用Ex Taq HS酶扩增（ 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）。PCR产物与pMD19-T载体连接后测序。总RNA溶液中加入等体积的Oligotex-dT30 mRNA Purification Binding Buffer（2×），按TaKaRa操作手册纯化mRNA。
1.3 cDNA合成5 μg mRNA为模板，按照TaKaRa cDNA Library Construction Kit操作手册进行反转录反应，合成的双链cDNA的3‘端含有XhoI酶切位点。双链cDNA两端连接EcoRI Adaptor后，XhoI酶切。反应体系移入Chroma Spin+TE-1000 Column中，700 g离心5 min，收集管中即为大于400bp的双链cDNA。
1.4 连接质粒载体质粒pBlueScriptII SK（+）进行EcoRI/XhoI双酶切。60 μl纯化的cDNA中加入200 ng开链pBlueScriptII SK（+），2 800 U T4 DNA Ligase，12℃过夜连接。连接产物回收，溶于20 μl TE。
1.5 cDNA文库鉴定取0.5 μl重组质粒1∶10稀释，预冷的0.1 cm冲击槽加入1 μl稀释液及100 μl E.coil DH10B进行电转化，冲击条件1.5 kV，200 Ω，25 μF；冰上加入预冷的SOC培养基1 ml，全量回收后37℃振荡培养1 h。分别取1 μl培养液1∶100，1∶200，1∶500稀释，10 μl稀释液涂布于LB琼脂糖筛选平板（含X-Gal 20 μg/ml，IPTG 24 mg/ml，Amp 100 μg/ml），37℃过夜培养。计算初始文库库容。取5 μl未稀释的培养物涂布于LB/Amp平板，37过夜培养后，加入LB/Amp液体培养基2 ml洗脱菌落并回收，计算初级文库滴度。
1.6 PCR检测插入片段随机挑取15个白色菌落，SOC/Amp培养基37℃过夜培养后，碱裂解法提取质粒，使用T7、T3引物进行PCR扩增。T7 引物：5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；T3引物：5'- ATTAACCCTCACTAAAGGGAA -3‘；PCR条件：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min。
2 结果
香菇作为一种常用的药用真菌在预防、治疗恶性肿瘤方面都具有重要价值，其多糖提取物主要为β-1,3键连接主链和β-1,6键连接支链的葡聚糖，能够提高机体免疫功能，间接抑制肿瘤的生长［1，2］，具有突出防癌抗癌、提高免疫力及缓解化疗反应等作用［3，4］，现已正式被作为辅助化疗药物应用于临床，香菇也被我国列为抗癌资源植物［5］。
香菇C91-3发酵液蛋白提取物能够抑制多种肿瘤细胞生长，大大延长荷瘤动物的生存期并且显着改善其生存状态。目前关于香菇C91-3发酵液中抗肿瘤效应蛋白的研究已经取得阶段性成果，本研究以香菇C91-3发酵液为RNA来源构建cDNA文库，以便进行分子生物学水平的后续研究。
本实验的RNA来源为香菇C91-3发酵液，为排除杂菌污染，作5SrRNA保守区段的PCR鉴定，扩增得到的5SrRNA IGR2片段与NCBI数据库中记录的香菇L54菌株吻合。距离树分析显示已知的担子菌类真菌5SrRNA IGR2变异较大，毒伞蕈与扩增片段的一致性为79%，松口蘑为78%，双色蜡蘑为77%。可见，香菇与这3种担子菌在进化上有一定差异。在模板及插入片段的制备过程中，经过多次纯化，大大降低了基因组DNA及cDNA短片段的影响，因此，本文库质量较高，初始库容达到7.2×106 cfu以上，即使是单拷贝基因也可以在本文库中找到，完全符合筛选文库要求。
社区护理论文发表 http://www.qikanba.com/
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