达肝清对小鼠肝细胞的药用作用研究-护理职称论文

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　　1 材料
　　1.1 动物
　　KM小鼠，SPF级，体质量（20±2.0）g,雌雄各半，广西壮族自治区药品检验所提供，许可证号：SCXK桂2003-0003。
　　1.2 药液制备
　　达肝清由三姐妹、黄根等药物组成（饮片由广西中医学院药学院蔡毅教授鉴定），经水提醇沉，滤液浓缩成浸膏，低温贮藏，用时用水稀释。
　　1.3 试剂
　　注射用苯巴比妥钠（上海新亚药业公司），细胞凋亡PI 荧光检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），RNase A（美国Sigma公司）， TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（德国Roche Applied Science公司），其余试剂均为国产分析纯。
　　1.4 仪器
　　显微镜（德国Leica公司），TGL-16M低温超速离心机（湖南塞特湘仪有限公司），EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），HH-8数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），EPICSXL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。
　　2 方法
　　2.1 动物分组及处理
　　小鼠60只，雌雄各半，共分为6组，每组10只，分别为空白对照组，非凋亡对照组，凋亡对照组，达肝清高剂量组（34 g/kg），达肝清中剂量组（17 g/kg），达肝清低剂量组（8.5 g/kg）。空白对照组ip无菌生理盐水，0.15 ml/10 g，1次/d，连续7 d；非凋亡对照组ip 0.5% PB，0.8 mg/10 g，0.15 ml/10 g，1次/d，连续7 d；凋亡对照组ip 0.5% PB,0.8 mg/10 g, 0.15 ml/10 g，1次/d，连续6 d。其余各药物组，首先ip 0.5% PB，0.8 mg/10 g，0.15 ml/10 g，1次/d，连续6 d。从撤除PB开始灌胃给药，0.2 ml/10 g，1次/6 h，至停PB后36 h。将所有小鼠脱颈处死，取肝组织。
　　2.2 流式细胞仪分析
　　取小鼠肝组织，分离肝细胞，用PBS 洗涤细胞1次（离心2 000 r/min，5 min）收集并调整细胞浓度为1×106/ml；细胞加9 倍体积的70%冰乙醇，于-20℃固定至少12 h；离心收集细胞后，用PBS 洗细胞以除去乙醇，细胞重悬于500 μl PBS 中；加入RNase A，使其终浓度为0.25 mg/ml, 37℃，反应30 min；加入5 μl PI 室温避光染色30 min；流式细胞仪检测凋亡率。
　　2.3 肝/体重比及组织学染色
　　取小鼠全部肝组织，沾除血渍，测肝重，计算肝/体质量比。取肝组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察，高倍镜下随机选取10个高倍视野，观察其形态学变化，计数凋亡细胞。
　　2.4   TUNEL反应
　　按照Roche Applied Science公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作步骤进行，光镜下观察，高倍镜下随机选取10个高倍视野，观察凋亡细胞形态并计数凋亡细胞。
　　2.5 统计学处理
　　所有数据通过SPSS11.0统计软件处理，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验， P<0.05认为有统计学差异。实验结果表明，达肝清在以34，17 g/kg剂量灌胃给药时，凋亡细胞计数明显低于凋亡对照组，能明显抑制苯巴比妥钠诱导的肝细胞凋亡，提示抑制肝细胞异常凋亡可能为其抗肝损伤的作用机理之一，为临床防治本病以及达肝清的进一步开发利用奠定了良好的基础。

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