丹参脂溶性成分丹参酮I和丹参酮ⅡA含量的测定实验-生物科研论文范文
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1 仪器与试药
HP1100高效液相色谱仪（美国Aglient公司），包括四元梯度泵（G1311A）， 二极管阵列检测器（G1315A）；DL-180型超声清洗器（浙江省象山县石浦天电子仪器厂）；FZ102微型植物试样粉碎机（河北省黄骅市齐家务振兴电器厂）；Milli - QG超纯水制备仪（美国Millipore公司）。
甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。丹参酮I和丹参酮ⅡA对照品纯度均大于99.5%，购自中国药品生物制品检定所。丹参（Salvia Miltiorrhiza Bunge）实验材料采于西北大学苗圃内的栽培植株（2006年3月自商洛天士力丹参药材基地移栽）。于2007-04 ～ 12期间每月20日以随机抽样的方式选择丹参植株6株，摘取各样品株的根、叶片和茎，分别整理，60℃的恒温箱内烘干至恒重，研细，过6号筛后备用。
2 方法
2.1 对照品溶液的配制分别精密称取对照品丹参酮I 1.1 mg和丹参酮ⅡA2.2 mg，分别置10 ml量瓶中，用二氯甲烷－甲醇（V/V = 1/9）混合溶剂溶解并定容，摇匀，得丹参酮I 浓度为0.11 mg·ml-1和丹参酮ⅡA浓度为0.22 mg·ml-1的单一成分对照品溶液，作为储备液，其它不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
2.2 供试品溶液的制备精密称量丹参根、茎、叶粉末约120 mg，置25 ml烧瓶中，准确加入二氯甲烷－甲醇（V/V = 1/9）混合溶剂10 ml，称重，超声提取30 min，冷却至室温，再称重，用提取液补足减失的质量，摇匀，取适量用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得丹参脂溶性成分供试品溶液。
2.3 色谱条件美国Zorbax SB - C18（150 mm × 4.6 mm, 5.0 μm）色谱柱；流动相为甲醇 － 0.4%磷酸，梯度洗脱，其时间程序为0→10→13 min，甲醇体积分数相应为72%→87%→72%，流速1.0 ml·min-1；二极管阵列检测器：检测波长分别为246, 270 nm；柱温30 ℃。丹参酮I和丹参酮ⅡA的保留时间分别为8.1，10.8 min。对照品和丹参样品色谱图见图1。
2.4 线性关系考察精密移取“2.1”项所配的丹参酮I和丹参酮ⅡA储备液一定体积于10 ml量瓶中，稀释，配成丹参酮I浓度分别为0.44，0.88，1.76，3.52，7.04，14.08 μg·ml-1及丹参酮ⅡA浓度分别为4.4，8.8，17.6，26.4，35.2，70.4 μg·ml-1的混合对照品溶液，将上述混合对照品溶液分别平行测定3次（均进样10.0 μl），以平均峰面积Y对浓度C（μg·ml-1）进行线性回归，丹参酮I和丹参酮ⅡA回归方程和相关系数分别为：Y = 74.61C - 118.86，r= 0.999 4；Y = 55.58C - 94.75，r = 0.999 6。线性范围分别为0.44 ～ 14.08，4.4 ～ 70.4 μg·ml-1。
2.5 精密度实验 精密吸取丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液10.0 μl，重复进样6次，进行测定，丹参酮I和丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为1.7%，1.9%。
2.6 稳定性实验 对丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液在8 h之内每隔1 h进行考察，结果丹参酮I和丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为2.1%，2.1%（n = 9）。
2.7 重复性实验 精密称量丹参（6月根）粉末约200 mg共6份，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液，进行测定，丹参酮I和丹参酮ⅡA含量的RSD分别为2.3%，2.5%。
2.8 加样回收率实验 精密称量丹参（6月根）粉末约60 mg，共6份，每份分别准确加入丹参酮I对照品储备液0.3 ml和丹参酮ⅡA对照品储备液1.0 ml，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液后，进行测定。丹参酮I和丹参酮ⅡA的平均加样回收率（n = 6）分别为99.4%，100.1%；RSD分别为2.3%，2.5%。
3 结果
按优化的高效液相色谱法对丹参的叶、茎、根中丹参酮I和丹参酮ⅡA的含量进行测定，每个样品重复测定3次，结果以平均含量计，本实验总脂溶性成分含量为丹参酮I和丹参酮ⅡA含量之和。丹参叶和茎中脂溶性成分含量经检测，丹参叶和茎中均未检出丹参酮I和丹参酮ⅡA。丹参根中脂溶性成分含量的季节变化在一个生长季节，丹参酮ⅡA和丹参酮I的含量变化规律大体呈“单峰”曲线（图2），丹参酮ⅡA的含量始终高于丹参酮I，丹参酮ⅡA从4月到7月份含量递增，7月份增至最高，为2.94%，以后含量递减，10月份后含量稳定在一个稍低的水平。丹参酮Ⅰ在4～5月份含量增加，5月份增至最高，为0.78%，以后含量逐渐降低。总丹参酮含量在7月份最高，约为10月份后稳定期含量的2.47倍。4～7月是丹参根中丹参酮积累的关键时期，7月份后是根生物量增加的重要阶段，根据这一特点，应合理施肥、管理，以获得产量高、有效成分含量高的丹参药材。
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1 仪器与试药
HP1100高效液相色谱仪（美国Aglient公司），包括四元梯度泵（G1311A）， 二极管阵列检测器（G1315A）；DL-180型超声清洗器（浙江省象山县石浦天电子仪器厂）；FZ102微型植物试样粉碎机（河北省黄骅市齐家务振兴电器厂）；Milli - QG超纯水制备仪（美国Millipore公司）。
甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。丹参酮I和丹参酮ⅡA对照品纯度均大于99.5%，购自中国药品生物制品检定所。丹参（Salvia Miltiorrhiza Bunge）实验材料采于西北大学苗圃内的栽培植株（2006年3月自商洛天士力丹参药材基地移栽）。于2007-04 ～ 12期间每月20日以随机抽样的方式选择丹参植株6株，摘取各样品株的根、叶片和茎，分别整理，60℃的恒温箱内烘干至恒重，研细，过6号筛后备用。
2 方法
2.1 对照品溶液的配制分别精密称取对照品丹参酮I 1.1 mg和丹参酮ⅡA2.2 mg，分别置10 ml量瓶中，用二氯甲烷－甲醇（V/V = 1/9）混合溶剂溶解并定容，摇匀，得丹参酮I 浓度为0.11 mg·ml-1和丹参酮ⅡA浓度为0.22 mg·ml-1的单一成分对照品溶液，作为储备液，其它不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。
2.2 供试品溶液的制备精密称量丹参根、茎、叶粉末约120 mg，置25 ml烧瓶中，准确加入二氯甲烷－甲醇（V/V = 1/9）混合溶剂10 ml，称重，超声提取30 min，冷却至室温，再称重，用提取液补足减失的质量，摇匀，取适量用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得丹参脂溶性成分供试品溶液。
2.3 色谱条件美国Zorbax SB - C18（150 mm × 4.6 mm, 5.0 μm）色谱柱；流动相为甲醇 － 0.4%磷酸，梯度洗脱，其时间程序为0→10→13 min，甲醇体积分数相应为72%→87%→72%，流速1.0 ml·min-1；二极管阵列检测器：检测波长分别为246, 270 nm；柱温30 ℃。丹参酮I和丹参酮ⅡA的保留时间分别为8.1，10.8 min。对照品和丹参样品色谱图见图1。
2.4 线性关系考察精密移取“2.1”项所配的丹参酮I和丹参酮ⅡA储备液一定体积于10 ml量瓶中，稀释，配成丹参酮I浓度分别为0.44，0.88，1.76，3.52，7.04，14.08 μg·ml-1及丹参酮ⅡA浓度分别为4.4，8.8，17.6，26.4，35.2，70.4 μg·ml-1的混合对照品溶液，将上述混合对照品溶液分别平行测定3次（均进样10.0 μl），以平均峰面积Y对浓度C（μg·ml-1）进行线性回归，丹参酮I和丹参酮ⅡA回归方程和相关系数分别为：Y = 74.61C - 118.86，r= 0.999 4；Y = 55.58C - 94.75，r = 0.999 6。线性范围分别为0.44 ～ 14.08，4.4 ～ 70.4 μg·ml-1。
2.5 精密度实验 精密吸取丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液10.0 μl，重复进样6次，进行测定，丹参酮I和丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为1.7%，1.9%。
2.6 稳定性实验 对丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液在8 h之内每隔1 h进行考察，结果丹参酮I和丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为2.1%，2.1%（n = 9）。
2.7 重复性实验 精密称量丹参（6月根）粉末约200 mg共6份，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液，进行测定，丹参酮I和丹参酮ⅡA含量的RSD分别为2.3%，2.5%。
2.8 加样回收率实验 精密称量丹参（6月根）粉末约60 mg，共6份，每份分别准确加入丹参酮I对照品储备液0.3 ml和丹参酮ⅡA对照品储备液1.0 ml，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液后，进行测定。丹参酮I和丹参酮ⅡA的平均加样回收率（n = 6）分别为99.4%，100.1%；RSD分别为2.3%，2.5%。
3 结果
按优化的高效液相色谱法对丹参的叶、茎、根中丹参酮I和丹参酮ⅡA的含量进行测定，每个样品重复测定3次，结果以平均含量计，本实验总脂溶性成分含量为丹参酮I和丹参酮ⅡA含量之和。丹参叶和茎中脂溶性成分含量经检测，丹参叶和茎中均未检出丹参酮I和丹参酮ⅡA。丹参根中脂溶性成分含量的季节变化在一个生长季节，丹参酮ⅡA和丹参酮I的含量变化规律大体呈“单峰”曲线（图2），丹参酮ⅡA的含量始终高于丹参酮I，丹参酮ⅡA从4月到7月份含量递增，7月份增至最高，为2.94%，以后含量递减，10月份后含量稳定在一个稍低的水平。丹参酮Ⅰ在4～5月份含量增加，5月份增至最高，为0.78%，以后含量逐渐降低。总丹参酮含量在7月份最高，约为10月份后稳定期含量的2.47倍。4～7月是丹参根中丹参酮积累的关键时期，7月份后是根生物量增加的重要阶段，根据这一特点，应合理施肥、管理，以获得产量高、有效成分含量高的丹参药材。
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