中药活性成分与血清白蛋白结合的研究-急诊急救论文
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1 仪器与材料
1.1 仪器
F-4500型分子荧光分光光度计（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可见光分光光度计（北京普析公司）；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋涡混合器，精密天平（Germany,Sartorius），pHS-3酸度计。J-810圆二色分光光度计（Japan，Jasco）；彩陆毛细管电泳系统（北京，中科院化学所），配紫外检测器和HW-001色谱工作站（中国，千谱软件有限公司）；未涂层石英毛细管，52 cm ×50 μm i.d.，有效长度为44 cm（中国河北永年光学纤维公司）；超滤管，截留分子量15 000（PALL FILTER CO., LTD, USA）；TGL－16型高速台式离心机（湘仪）。
1.2 试剂
牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5 mol/L的储备溶液，4 ℃保存备用；18β－甘草次酸（GA，≥97%,Fluka, product of Spain）；槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素对照品，购自中国药品与生物制品检定所（中国北京）；甲基莲心碱（由中南大学湘雅医院药剂科刘韶惠赠，HPLC纯度大于98％）；中药活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl缓冲溶液；Tris（淮安和元化工有限公司），氯化钠二水磷酸二氢钠（河南焦作），盐酸（湖南师范大学化学试剂厂）。除已标明者外，试剂均为分析纯；水为双重蒸馏水。
2 方法
2.1 光谱实验方法
2.1.1 荧光猝灭方法
在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液、2 ml BSA储备溶液，以水定容为10 ml, 摇匀， 在一定温度下静置30 min。取该溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定体积的中药活性成分溶液（加入总量＜0.03 ml），旋涡混匀。经指定温度下恒温放置3 min后，在280 nm的激发波长下，扫描290～420 nm荧光光谱。在相同条件下，测其紫外光谱。甘草次酸对中药活性成分的影响是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法进行。在实验条件下活性成分在290～450 nm范围内吸收很小，荧光内滤作用可以忽略，故直接对数据进行处理，结果为3次平行实验的平均值。
2.1.2 圆二色（CD）谱方法
光源系统用氮气保护（流量为5 L/min），样品池的光径为0.1 cm。测量参数：扫描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，响应时间1 s，累积次数3次，扫描波段为190～250 nm，BSA浓度为2×10-6 mol/L，实验时向BSA中分别加入不同量的甘草次酸，混合均匀后测量，得到其CD谱。
2.2 毛细管电泳前沿分析（CE-FA）方法
CE运行缓冲是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸钠，由适量的二水磷酸二氢钠溶解于水，然后在pH计上用2 mmol/L NaOH调节到指定的酸度，再经过0.45 μm滤膜过滤。BSA储备液（200 mmol/L）是通过溶解适量的BSA粉末于运行缓冲中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由储备液用运行缓冲稀释而得。药物储备液（2 mmol/L）由运行缓冲配制，内含30％（V/V）以下甲醇。药物工作液由其储备液通过运行缓冲稀释而得，其中甲醇含量小于3％（V/V）。药物的标准溶液也用于配制其校准曲线，游离浓度由校准曲线求得。所有测试溶液在应用前进行脱气。
一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 μmol/L） ，加入等量的GA至 160 μmol/L，再加入缓冲至1 ml，涡旋混合30 s。然后在36℃水浴加热孵化2 h，再于室温下平衡2 h。若要进行超滤，则于室温平衡后进行，即取适量平衡液于超滤管，然后16 000 r/min下进行分离，滤液由CE进行测定。试样重复两份，结果取平均值，毛细管电泳在室温下进行。
新毛细管要做预处理，以1 mol/L HCl 冲洗30 min，水冲洗5 min，1 mol/L NaOH冲洗30 min，然后水冲洗5 min，磷酸盐缓冲冲洗15 min。为了获得较好的峰形和迁移时间的重现性，毛细管在每天实验开始按照下列程序进行冲洗和平衡：水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2 min，缓冲冲洗5 min。
在每次测量之间，毛细管以水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2 min，再以缓冲冲洗2 min。在这样的条件下，可以保证消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超滤液重力进样60 s（毛细管进出口高度差为30 cm）。运行电压为19 kV，常规极性运行，典型电流为85 mA，紫外检测波长为254 nm。
3 结果
3.1 甘草次酸与BSA作用的研究
3.1.1 甘草次酸对BSA 的荧光猝灭光谱甘草次酸在与BSA 作用的过程中能显着地猝灭BSA 的荧光，这种猝灭在GA加入便可迅速观察到，这提示［10］BSA的一个高亲和结合位点位于色氨酸残基的附近。测得297 K甘草次酸对BSA的荧光猝灭光谱见图1。在此过程中，GA/BSA=3时，最大发射峰由341 nm变为最终的337 nm，略有蓝移，显示色氨酸残基所处环境的疏水性增加。并最终移至334 nm，在研究范围内荧光强度下降87.6％，说明GA和BSA发生了结合作用，并使BSA的构象发生了变化。此外，可以观察到色氨酸荧光下降幅度比酪氨酸大。见图1。
3.1.2 荧光猝灭作用的Stern-Volmer分析见图2。图2是根据Stern-Volmer 猝灭方程（方程1）作图，式中，F为有猝灭剂时BSA 的荧光强度， F0为无猝灭剂时BSA 的荧光强度， ［Q］为猝灭剂浓度，KSV 为动态猝灭常数，Kq 为动态荧光猝灭速率常数， 各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010 L·mol-1·s-1［1］；τ0 为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命。从图2可见，在pH 7.40时，猝灭呈现两种不同的模式，这表明，GA与BSA的有两类不同的结合位点。由斜率求的前半段（［GA］/ ［BSA］≈3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1, R=0.999 1；在292 K, Kq=2.26×1013 L·mol-1·s-1, R=0.997 5；在287 K, Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1, R=0.998 8。而GA与BSA浓度比大于3之后也有较好的线性，297 K时Kq为2.74×1012 L·mol-1·s-1。很显然，由于由于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散控制的碰撞猝灭常数为2.0×1010 L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝灭速率常数远远大于此值，由此可见，GA对BSA的两类猝灭不是动态而是静态猝灭。
3.1.4 甘草次酸与BSA结合的热力学参数及作用力药物小分子与生物大分子的作用力包括氢键，范德华力，静电引力，疏水作用力等，药物不同，与牛血清白蛋白作用力类型也不相同。
3.1.5 甘草次酸在BSA结合位点的确定血清白蛋白至少有三个特异的高亲和药物结合位点，分别称为药物结合的site Ⅰ～Ⅲ。血清白蛋白的重要结合位点位于site I 和siteⅡ，分别对应于ⅡA和ⅢA亚结构域。许多药物对血清白蛋白的结合具有特异性，如苯基保泰松（PB）结合于site I，氯灭酸（FA）和布洛芬（IB）结合于siteⅢ，地高辛（digitoxin）结合于site Ⅲ，这些药物可以用作位置探针（site-probe）。本试验利用PB、FA和IB作为位置探针，研究GA与这些药物的竞争结合情况。在与BSA等物质的量的PB、FA和IB存在下，利用方程进行计算，相应的结合常数K的数值分别为，1.72×105，R=0.999 6; 9.04×105，R=0.999 2；9.48×105, R=0.994 8。 考虑到在同样条件下，无探针时结合常数K是8.28×105，显然GA与BSA的结合受到PB的影响较大而几乎不受FA和IB的影响。因此，可以推断site I是GA的高亲和结合位点之一。
3.1.6 甘草次酸与BSA结合距离GA的吸收光谱和BSA的发射光谱存在重叠。根据F ster［11］-偶极非辐射能量转移理论。求重叠光谱的积分，J＝8.926×10-15 cm3·L·mol-1。用K2=2/3, N=1.36, Φ=0.15［1］，求得R0＝2.47 nm，而计算得能量转移效率E＝0.514，最后可以得到GA到色氨酸残基的距离r=2.45 nm。r和R0的数值均在理论的范围内，转移的距离r <7 nm 且0.5R0 < r< 1.5R0 ［11］，显示在GA和BSA之间发生非辐射能量转移的可能性是很大的，从而使荧光猝灭。
3.1.7 圆二色谱研究甘草次酸对BSA构象的影响图4是BSA在GA存在下的圆二色谱。由图可见，BSA在210 nm和220 nm附近有明显的负峰，GA加入使峰强度呈现减少的趋势，GA浓度不大时，强度变化不大。根据文献［11］计算方法，得不同GA浓度下BSA中α螺旋的比例的变化情况（表2），结果表明GA加入对BSA构象产生影响，α螺旋的比例下降。
3.2 甘草次酸对中药活性成分与BSA作用的影响用荧光猝灭法对槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素、甲基莲心碱与BSA的结合进行了研究，同时探讨了甘草次酸对活性成分结合的影响。所选取的黄酮（苷）和大黄酸、大黄素等都能明显地猝灭BSA的荧光，猝灭数据直接按照方程①、②、⑥行处理，结果（3次平行试验）列于表3。从表可以看出，黄酮比相应的黄酮苷的结合要强，苷元的结合要比对应的苷的结合强。甘草次酸对黄酮苷的结合有很大的影响，结合常数下降54.6%～67.3%。甘草次酸的存在使山萘酚和槲皮素的结合常数有所下降，而对大黄酸、大黄素和甲基莲心碱的结合常数影响较少。从结合常数看，黄酮苷一般在104，而其它几种物质与GA都为105，可见中药活性成分与GA结合常数的相对大小可能是影响甘草次酸能否对其结合产生影响的一个重要因素之一。故甘草次酸可能对其它中药活性成分的药理作用产生影响。
急诊科护理论文 http://www.qikanba.com/
1 仪器与材料
1.1 仪器
F-4500型分子荧光分光光度计（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可见光分光光度计（北京普析公司）；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋涡混合器，精密天平（Germany,Sartorius），pHS-3酸度计。J-810圆二色分光光度计（Japan，Jasco）；彩陆毛细管电泳系统（北京，中科院化学所），配紫外检测器和HW-001色谱工作站（中国，千谱软件有限公司）；未涂层石英毛细管，52 cm ×50 μm i.d.，有效长度为44 cm（中国河北永年光学纤维公司）；超滤管，截留分子量15 000（PALL FILTER CO., LTD, USA）；TGL－16型高速台式离心机（湘仪）。
1.2 试剂
牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5 mol/L的储备溶液，4 ℃保存备用；18β－甘草次酸（GA，≥97%,Fluka, product of Spain）；槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素对照品，购自中国药品与生物制品检定所（中国北京）；甲基莲心碱（由中南大学湘雅医院药剂科刘韶惠赠，HPLC纯度大于98％）；中药活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl缓冲溶液；Tris（淮安和元化工有限公司），氯化钠二水磷酸二氢钠（河南焦作），盐酸（湖南师范大学化学试剂厂）。除已标明者外，试剂均为分析纯；水为双重蒸馏水。
2 方法
2.1 光谱实验方法
2.1.1 荧光猝灭方法
在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液、2 ml BSA储备溶液，以水定容为10 ml, 摇匀， 在一定温度下静置30 min。取该溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定体积的中药活性成分溶液（加入总量＜0.03 ml），旋涡混匀。经指定温度下恒温放置3 min后，在280 nm的激发波长下，扫描290～420 nm荧光光谱。在相同条件下，测其紫外光谱。甘草次酸对中药活性成分的影响是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法进行。在实验条件下活性成分在290～450 nm范围内吸收很小，荧光内滤作用可以忽略，故直接对数据进行处理，结果为3次平行实验的平均值。
2.1.2 圆二色（CD）谱方法
光源系统用氮气保护（流量为5 L/min），样品池的光径为0.1 cm。测量参数：扫描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，响应时间1 s，累积次数3次，扫描波段为190～250 nm，BSA浓度为2×10-6 mol/L，实验时向BSA中分别加入不同量的甘草次酸，混合均匀后测量，得到其CD谱。
2.2 毛细管电泳前沿分析（CE-FA）方法
CE运行缓冲是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸钠，由适量的二水磷酸二氢钠溶解于水，然后在pH计上用2 mmol/L NaOH调节到指定的酸度，再经过0.45 μm滤膜过滤。BSA储备液（200 mmol/L）是通过溶解适量的BSA粉末于运行缓冲中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由储备液用运行缓冲稀释而得。药物储备液（2 mmol/L）由运行缓冲配制，内含30％（V/V）以下甲醇。药物工作液由其储备液通过运行缓冲稀释而得，其中甲醇含量小于3％（V/V）。药物的标准溶液也用于配制其校准曲线，游离浓度由校准曲线求得。所有测试溶液在应用前进行脱气。
一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 μmol/L） ，加入等量的GA至 160 μmol/L，再加入缓冲至1 ml，涡旋混合30 s。然后在36℃水浴加热孵化2 h，再于室温下平衡2 h。若要进行超滤，则于室温平衡后进行，即取适量平衡液于超滤管，然后16 000 r/min下进行分离，滤液由CE进行测定。试样重复两份，结果取平均值，毛细管电泳在室温下进行。
新毛细管要做预处理，以1 mol/L HCl 冲洗30 min，水冲洗5 min，1 mol/L NaOH冲洗30 min，然后水冲洗5 min，磷酸盐缓冲冲洗15 min。为了获得较好的峰形和迁移时间的重现性，毛细管在每天实验开始按照下列程序进行冲洗和平衡：水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2 min，缓冲冲洗5 min。
在每次测量之间，毛细管以水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2 min，再以缓冲冲洗2 min。在这样的条件下，可以保证消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超滤液重力进样60 s（毛细管进出口高度差为30 cm）。运行电压为19 kV，常规极性运行，典型电流为85 mA，紫外检测波长为254 nm。
3 结果
3.1 甘草次酸与BSA作用的研究
3.1.1 甘草次酸对BSA 的荧光猝灭光谱甘草次酸在与BSA 作用的过程中能显着地猝灭BSA 的荧光，这种猝灭在GA加入便可迅速观察到，这提示［10］BSA的一个高亲和结合位点位于色氨酸残基的附近。测得297 K甘草次酸对BSA的荧光猝灭光谱见图1。在此过程中，GA/BSA=3时，最大发射峰由341 nm变为最终的337 nm，略有蓝移，显示色氨酸残基所处环境的疏水性增加。并最终移至334 nm，在研究范围内荧光强度下降87.6％，说明GA和BSA发生了结合作用，并使BSA的构象发生了变化。此外，可以观察到色氨酸荧光下降幅度比酪氨酸大。见图1。
3.1.2 荧光猝灭作用的Stern-Volmer分析见图2。图2是根据Stern-Volmer 猝灭方程（方程1）作图，式中，F为有猝灭剂时BSA 的荧光强度， F0为无猝灭剂时BSA 的荧光强度， ［Q］为猝灭剂浓度，KSV 为动态猝灭常数，Kq 为动态荧光猝灭速率常数， 各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010 L·mol-1·s-1［1］；τ0 为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命。从图2可见，在pH 7.40时，猝灭呈现两种不同的模式，这表明，GA与BSA的有两类不同的结合位点。由斜率求的前半段（［GA］/ ［BSA］≈3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1, R=0.999 1；在292 K, Kq=2.26×1013 L·mol-1·s-1, R=0.997 5；在287 K, Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1, R=0.998 8。而GA与BSA浓度比大于3之后也有较好的线性，297 K时Kq为2.74×1012 L·mol-1·s-1。很显然，由于由于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散控制的碰撞猝灭常数为2.0×1010 L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝灭速率常数远远大于此值，由此可见，GA对BSA的两类猝灭不是动态而是静态猝灭。
3.1.4 甘草次酸与BSA结合的热力学参数及作用力药物小分子与生物大分子的作用力包括氢键，范德华力，静电引力，疏水作用力等，药物不同，与牛血清白蛋白作用力类型也不相同。
3.1.5 甘草次酸在BSA结合位点的确定血清白蛋白至少有三个特异的高亲和药物结合位点，分别称为药物结合的site Ⅰ～Ⅲ。血清白蛋白的重要结合位点位于site I 和siteⅡ，分别对应于ⅡA和ⅢA亚结构域。许多药物对血清白蛋白的结合具有特异性，如苯基保泰松（PB）结合于site I，氯灭酸（FA）和布洛芬（IB）结合于siteⅢ，地高辛（digitoxin）结合于site Ⅲ，这些药物可以用作位置探针（site-probe）。本试验利用PB、FA和IB作为位置探针，研究GA与这些药物的竞争结合情况。在与BSA等物质的量的PB、FA和IB存在下，利用方程进行计算，相应的结合常数K的数值分别为，1.72×105，R=0.999 6; 9.04×105，R=0.999 2；9.48×105, R=0.994 8。 考虑到在同样条件下，无探针时结合常数K是8.28×105，显然GA与BSA的结合受到PB的影响较大而几乎不受FA和IB的影响。因此，可以推断site I是GA的高亲和结合位点之一。
3.1.6 甘草次酸与BSA结合距离GA的吸收光谱和BSA的发射光谱存在重叠。根据F ster［11］-偶极非辐射能量转移理论。求重叠光谱的积分，J＝8.926×10-15 cm3·L·mol-1。用K2=2/3, N=1.36, Φ=0.15［1］，求得R0＝2.47 nm，而计算得能量转移效率E＝0.514，最后可以得到GA到色氨酸残基的距离r=2.45 nm。r和R0的数值均在理论的范围内，转移的距离r <7 nm 且0.5R0 < r< 1.5R0 ［11］，显示在GA和BSA之间发生非辐射能量转移的可能性是很大的，从而使荧光猝灭。
3.1.7 圆二色谱研究甘草次酸对BSA构象的影响图4是BSA在GA存在下的圆二色谱。由图可见，BSA在210 nm和220 nm附近有明显的负峰，GA加入使峰强度呈现减少的趋势，GA浓度不大时，强度变化不大。根据文献［11］计算方法，得不同GA浓度下BSA中α螺旋的比例的变化情况（表2），结果表明GA加入对BSA构象产生影响，α螺旋的比例下降。
3.2 甘草次酸对中药活性成分与BSA作用的影响用荧光猝灭法对槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素、甲基莲心碱与BSA的结合进行了研究，同时探讨了甘草次酸对活性成分结合的影响。所选取的黄酮（苷）和大黄酸、大黄素等都能明显地猝灭BSA的荧光，猝灭数据直接按照方程①、②、⑥行处理，结果（3次平行试验）列于表3。从表可以看出，黄酮比相应的黄酮苷的结合要强，苷元的结合要比对应的苷的结合强。甘草次酸对黄酮苷的结合有很大的影响，结合常数下降54.6%～67.3%。甘草次酸的存在使山萘酚和槲皮素的结合常数有所下降，而对大黄酸、大黄素和甲基莲心碱的结合常数影响较少。从结合常数看，黄酮苷一般在104，而其它几种物质与GA都为105，可见中药活性成分与GA结合常数的相对大小可能是影响甘草次酸能否对其结合产生影响的一个重要因素之一。故甘草次酸可能对其它中药活性成分的药理作用产生影响。
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