桂枝抑制心肌细胞凋亡效果的实验研究-急诊医学论文
急诊医学论文 急诊护理论文 中华医学杂志投稿 医学护理论文
1 材料与仪器
1.1 动物
8～10周龄雌性MRL小鼠，体质量20～25 g，由上海动物中心提供。
1.2 药品桂枝药物由河北工程大学附属教学中医院提供，强的松片由浙江仙居制药厂生产。
1.3 试剂RNA提取试剂Trizol Reagent购自华美生物工程公司，为Invitrogen公司产品；逆转录酶（AMV-RT ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均购自美国Promega 公司。
1.4 仪器756型紫外分光光度计为上海精密仪器厂生产；GeneAmp 9600型PCR仪 为美国PE公司生产；RS-28高速低温离心机为 德国贺利氏公司生产；超低温冰箱为德国贺利氏公司生产；UVP凝胶扫描系统由美国UVP 公司生产；微量移液器 为德国Gilson公司生产；DYZ-22A型双恒定时电泳仪为北京市六一仪器厂生产；DYY-Ⅲ桥式电泳仪为北京市六一仪器厂生产。
2 方法
2.1 实验分组与给药36只雌性MRL小鼠，随机分为3组，即空白对照组，强的松组，桂枝组，各12只。空白对照组给予生理盐水灌胃1ml/d，强的松组给予强的松混悬液灌胃0.02 g·ml-1·d-1，桂枝组给予桂枝煎剂0.12 g·ml-1·d-1，分两次给予，各组灌胃3周后处死动物，取心室肌组织。
2.2 检测指标与方法
2.2.1 心肌细胞凋亡Ladder电泳用碱裂解法提取心肌ＭＤＡ，洗涤，ＴＥ过夜溶解。制备1 5%的琼脂糖凝胶，加入DNA样品，以5V/cm的电压电泳1～2ｈ，紫外透射仪观察DNA条带，成像、照片。
2.2.2 凋亡及相关基因检测迅速分离心脏，常规石蜡包埋，切片数张。心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）标记凋亡细胞核的3‘末端。分离MRL小鼠心脏，使用200℃干烤的器械于手术台上留取100 mg心室肌组织，迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后，置冻存管中保存于液氮中，M-Caspase 3基因按照相应的RT-PCR实验流程进行检测，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成，RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含GoldView染料）上电泳，120V，25min，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析结果。
2.3 图像分析用图像分析仪900倍放大凋亡和免疫组化切片，每张片随机取10个视野，测定阳性染色的平均吸光度与阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数（AI）。
2.4 统计方法所有数据用SPSS11.5软件处理。数据以±ｓ表示。多组间比较用方差分析，两两比较用ｑ检验，率检验用χ2分析。
3 结果
3.1 桂枝对MRL小鼠心肌组织DNA凋亡Ladder发生率的影响空白对照组MRL小鼠通过DNA琼脂糖电泳可见凋亡Ladder的发生率明显较其它组高。桂枝组和强的松组心肌细胞凋亡Ladder的发生率明显下降，两组与空白对照组相比经χ2检验，Ｐ<0 01，差异有显着性。桂枝对心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响空白对照组MRL小鼠凋亡指数和M-Caspase 3基因表达较高，与之相比，桂枝组和强的松组的心肌细胞凋亡指数和Caspase 3基因表达明显降低，（Ｐ<0.01），差异有显着性。桂枝组和强的松组相比无显着性差异（Ｐ>0.05）。
急诊护理学论文范文 http://www.qikanba.com/
1 材料与仪器
1.1 动物
8～10周龄雌性MRL小鼠，体质量20～25 g，由上海动物中心提供。
1.2 药品桂枝药物由河北工程大学附属教学中医院提供，强的松片由浙江仙居制药厂生产。
1.3 试剂RNA提取试剂Trizol Reagent购自华美生物工程公司，为Invitrogen公司产品；逆转录酶（AMV-RT ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均购自美国Promega 公司。
1.4 仪器756型紫外分光光度计为上海精密仪器厂生产；GeneAmp 9600型PCR仪 为美国PE公司生产；RS-28高速低温离心机为 德国贺利氏公司生产；超低温冰箱为德国贺利氏公司生产；UVP凝胶扫描系统由美国UVP 公司生产；微量移液器 为德国Gilson公司生产；DYZ-22A型双恒定时电泳仪为北京市六一仪器厂生产；DYY-Ⅲ桥式电泳仪为北京市六一仪器厂生产。
2 方法
2.1 实验分组与给药36只雌性MRL小鼠，随机分为3组，即空白对照组，强的松组，桂枝组，各12只。空白对照组给予生理盐水灌胃1ml/d，强的松组给予强的松混悬液灌胃0.02 g·ml-1·d-1，桂枝组给予桂枝煎剂0.12 g·ml-1·d-1，分两次给予，各组灌胃3周后处死动物，取心室肌组织。
2.2 检测指标与方法
2.2.1 心肌细胞凋亡Ladder电泳用碱裂解法提取心肌ＭＤＡ，洗涤，ＴＥ过夜溶解。制备1 5%的琼脂糖凝胶，加入DNA样品，以5V/cm的电压电泳1～2ｈ，紫外透射仪观察DNA条带，成像、照片。
2.2.2 凋亡及相关基因检测迅速分离心脏，常规石蜡包埋，切片数张。心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）标记凋亡细胞核的3‘末端。分离MRL小鼠心脏，使用200℃干烤的器械于手术台上留取100 mg心室肌组织，迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后，置冻存管中保存于液氮中，M-Caspase 3基因按照相应的RT-PCR实验流程进行检测，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成，RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含GoldView染料）上电泳，120V，25min，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析结果。
2.3 图像分析用图像分析仪900倍放大凋亡和免疫组化切片，每张片随机取10个视野，测定阳性染色的平均吸光度与阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数（AI）。
2.4 统计方法所有数据用SPSS11.5软件处理。数据以±ｓ表示。多组间比较用方差分析，两两比较用ｑ检验，率检验用χ2分析。
3 结果
3.1 桂枝对MRL小鼠心肌组织DNA凋亡Ladder发生率的影响空白对照组MRL小鼠通过DNA琼脂糖电泳可见凋亡Ladder的发生率明显较其它组高。桂枝组和强的松组心肌细胞凋亡Ladder的发生率明显下降，两组与空白对照组相比经χ2检验，Ｐ<0 01，差异有显着性。桂枝对心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响空白对照组MRL小鼠凋亡指数和M-Caspase 3基因表达较高，与之相比，桂枝组和强的松组的心肌细胞凋亡指数和Caspase 3基因表达明显降低，（Ｐ<0.01），差异有显着性。桂枝组和强的松组相比无显着性差异（Ｐ>0.05）。
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