何首乌饮对下丘脑衰老的干预作用研究-术后护理毕业论文
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1 材料
1.1 实验动物的选择选用清洁级8周龄雌性SD大鼠105只，体质量180～220 g（购自河北医科大学实验动物学部，合格证编号：605106）。根据实验目的和要求将SD大鼠随机分为以下各组，正常对照组（15只）、模型组（15只）、何首乌饮延缓衰老组（高、中、低剂量组各15只）、自然恢复组（15只）、VE阳性对照组（15只）。
1.2 动物模型的建立和各组动物的处理用D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老动物模型：用生理盐水配成6%的溶液，按300 mg·kg-1·d-1给药，连续60 d,1次/d。延缓衰老组和阳性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃何首乌饮、维生素E，连续60 d；自然恢复组每天灌胃生理盐水，时间同上。
1.3 药物溶液的制备何首乌饮方剂组成：何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓等，按重量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，剪碎，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，过滤后浓缩至含生药分别为2.4，4.8，9.6 g/ml（分别作为低、中、高剂量药液）。4℃保存，给药前复温至25～30℃。维生素E溶液：用0.5%羧甲基纤维素钠稀释为含维生素E 0.005 5 g/ml药液。4℃保存，给药前复温至25～30℃。标本的采集及处理动物断头处死，取出全脑后迅速投入液氮中，保存待测。
2 方法
2.1 下丘脑GnRH、SP和β-EP含量的测定用直径2.5 mm的套管刀在大鼠脑腹侧视交叉后方打孔取下丘脑，组织柱长约5 mm，称重，匀浆器中加入800 μl细胞裂解液（0.15 mol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 1%TritonX-100, 10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl, 1∶1000的5 mol/L DTT, 1∶1000的100mmol/L PMSF），冰浴下将组织研磨成浆后4℃离心取上清。分别用双抗夹心ELISA法检测GnRH、SP、β-EP（GnRH、SP、β-EP试剂购自R＆B公司）。
2.2 下丘脑单胺类神经递质含量的测定
2.2.1 对照品溶液的配制精确称取对照品去甲肾上腺素
（noradrenaline, NA）、多巴胺（dopamine, DA）、5-羟色胺（5-hydroxytrypatmien, 5-HT），配成浓度分别为30，15，10 ng/μl的标准混合溶液500 ml。（NA、DA、5-HT试剂购自FLUCA公司）。
2.2.2 样品制备取下丘脑，称重后置于400 μl 0.1 mol/L高氯酸溶液中，冰浴下用内切式匀浆器匀浆，4℃离心40 min，取上清液10 μl进样。
2.2.3 色谱条件流动相：乙酸钠缓冲液-甲醇（96∶4），过饱和柠檬酸调pH=4.9；流速：1.2 ml/min；色谱柱：Discovery C18 （250 mm×4.6 mm）5 μm；柱温：室温。精密量取上述对照品混合溶液各0.1，1，3，6 ml，分别置于10 ml容量瓶中，双蒸水稀释至刻度，得到一系列浓度的标准品混合溶液，分别取10 μl进样，记录峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为从纵坐标作标准曲线，并进行回归计算，所得回归方程分别为：NA：Y=69.319 6+70 146.292 7X，r=0.999 9；DA：Y=3 557.920 3+7 771 405X，r=0.999 8；5-HT：Y=-9 252.252 8+168 666.729 5X，r=0.999 9。说明NA在0.290～28.96 ng/μl范围内、DA在0.16～28.96 ng/μl范围内、5-HT在0.102～10.20 ng/μl范围内线性关系良好。
2.2.4 精密度测定取对照品混合溶液10 μl进样，重复进样5次，分别记录色谱峰面积积分值，计算RSD为1.02%，说明仪器精密度和操作精密度较好。溶液稳定性检测将对照品混合溶液在0，1，3，5，7 h分别进样，进样量为10 μl，分别记录色谱峰面积积分值，计算RSD为2.31%，说明在7 h之内对照品混合溶液基本稳定。
2.2.5 回收率测定在4组下丘脑组织匀浆上清液中以一组为空白组，另三组分别加1，2，3 ng的NA、DA、5-HT标准混合液，10 μl进样。测得值分别减去空白组测得值，然后分别除以1，2，3，得回收百分率。各组n=5，结果见表1。结果表明上述含量测定方法回收率良好。 下丘脑GnRH、SP和β-EP的变化模型组下丘脑GnRH、SP明显增高，β-EP明显降低，与正常组相比有显着差异（P<0.05）；何首乌饮能够明显提高β-EP的含量，降低GnRH、SP的浓度，何首乌饮高剂量组明显好于其它各组（P<0.05）。
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1.1 实验动物的选择选用清洁级8周龄雌性SD大鼠105只，体质量180～220 g（购自河北医科大学实验动物学部，合格证编号：605106）。根据实验目的和要求将SD大鼠随机分为以下各组，正常对照组（15只）、模型组（15只）、何首乌饮延缓衰老组（高、中、低剂量组各15只）、自然恢复组（15只）、VE阳性对照组（15只）。
1.2 动物模型的建立和各组动物的处理用D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老动物模型：用生理盐水配成6%的溶液，按300 mg·kg-1·d-1给药，连续60 d,1次/d。延缓衰老组和阳性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃何首乌饮、维生素E，连续60 d；自然恢复组每天灌胃生理盐水，时间同上。
1.3 药物溶液的制备何首乌饮方剂组成：何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓等，按重量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，剪碎，水浸泡1 h，然后水煎2次，30 min/次，过滤后浓缩至含生药分别为2.4，4.8，9.6 g/ml（分别作为低、中、高剂量药液）。4℃保存，给药前复温至25～30℃。维生素E溶液：用0.5%羧甲基纤维素钠稀释为含维生素E 0.005 5 g/ml药液。4℃保存，给药前复温至25～30℃。标本的采集及处理动物断头处死，取出全脑后迅速投入液氮中，保存待测。
2 方法
2.1 下丘脑GnRH、SP和β-EP含量的测定用直径2.5 mm的套管刀在大鼠脑腹侧视交叉后方打孔取下丘脑，组织柱长约5 mm，称重，匀浆器中加入800 μl细胞裂解液（0.15 mol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 1%TritonX-100, 10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl, 1∶1000的5 mol/L DTT, 1∶1000的100mmol/L PMSF），冰浴下将组织研磨成浆后4℃离心取上清。分别用双抗夹心ELISA法检测GnRH、SP、β-EP（GnRH、SP、β-EP试剂购自R＆B公司）。
2.2 下丘脑单胺类神经递质含量的测定
2.2.1 对照品溶液的配制精确称取对照品去甲肾上腺素
（noradrenaline, NA）、多巴胺（dopamine, DA）、5-羟色胺（5-hydroxytrypatmien, 5-HT），配成浓度分别为30，15，10 ng/μl的标准混合溶液500 ml。（NA、DA、5-HT试剂购自FLUCA公司）。
2.2.2 样品制备取下丘脑，称重后置于400 μl 0.1 mol/L高氯酸溶液中，冰浴下用内切式匀浆器匀浆，4℃离心40 min，取上清液10 μl进样。
2.2.3 色谱条件流动相：乙酸钠缓冲液-甲醇（96∶4），过饱和柠檬酸调pH=4.9；流速：1.2 ml/min；色谱柱：Discovery C18 （250 mm×4.6 mm）5 μm；柱温：室温。精密量取上述对照品混合溶液各0.1，1，3，6 ml，分别置于10 ml容量瓶中，双蒸水稀释至刻度，得到一系列浓度的标准品混合溶液，分别取10 μl进样，记录峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为从纵坐标作标准曲线，并进行回归计算，所得回归方程分别为：NA：Y=69.319 6+70 146.292 7X，r=0.999 9；DA：Y=3 557.920 3+7 771 405X，r=0.999 8；5-HT：Y=-9 252.252 8+168 666.729 5X，r=0.999 9。说明NA在0.290～28.96 ng/μl范围内、DA在0.16～28.96 ng/μl范围内、5-HT在0.102～10.20 ng/μl范围内线性关系良好。
2.2.4 精密度测定取对照品混合溶液10 μl进样，重复进样5次，分别记录色谱峰面积积分值，计算RSD为1.02%，说明仪器精密度和操作精密度较好。溶液稳定性检测将对照品混合溶液在0，1，3，5，7 h分别进样，进样量为10 μl，分别记录色谱峰面积积分值，计算RSD为2.31%，说明在7 h之内对照品混合溶液基本稳定。
2.2.5 回收率测定在4组下丘脑组织匀浆上清液中以一组为空白组，另三组分别加1，2，3 ng的NA、DA、5-HT标准混合液，10 μl进样。测得值分别减去空白组测得值，然后分别除以1，2，3，得回收百分率。各组n=5，结果见表1。结果表明上述含量测定方法回收率良好。 下丘脑GnRH、SP和β-EP的变化模型组下丘脑GnRH、SP明显增高，β-EP明显降低，与正常组相比有显着差异（P<0.05）；何首乌饮能够明显提高β-EP的含量，降低GnRH、SP的浓度，何首乌饮高剂量组明显好于其它各组（P<0.05）。
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