冻耳治疗后病理变化实验研究-优质护理服务创新论文
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1 仪器与材料
1.1 仪器
2010型酶标仪（奥地利Anthos Labtec Instruments公司）；756MC紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试药
取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24 h），合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65 g；MDA和SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20071228，20071227）；TNFα试剂盒（美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司，批号：RT110371）。
1.3 动物
日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0 kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（滇）2005-0008。
2 方法
2.1 冻伤模型复制与给药
［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6 d后将右耳耳尖至耳根7 cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。待兔耳变白变硬后再冻30 s，取出，空气中停留20 s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1 ml/次，3次/d，涂药4 d后，治疗结束。
2.2 冻耳病理检查
治疗4 d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部分，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部分剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α测定），分别在耳尖向耳根方向1，2，3 cm处取材，常规石蜡包埋，HE染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。
2.3 SOD、MDA和TNFα测定
［8］涂药2 d后，左耳中央动脉取血约4 ml。涂药4 d后心脏取血约4 ml，取“2.3”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事先盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，取出，滤纸吸干水分，称1 g耳尖部组织，用10ml预冷pH7.4的0.01 mol/L的PBS制备组织匀浆。血液与组织匀浆4℃分别以4 000 r/min和2 000 r/min离心10 min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方法测定SOD总活力、MDA与TNF-α含量。
3 结果
3.1 冻耳外观变化
复温后兔耳开始发红发热，随后变紫、肿胀、下垂。肿胀逐渐加剧，12 h后部分兔耳出现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成。24 h后肿胀程度不再增加，水泡不再增大或无新水泡形成。48 h后部分兔耳冻区有黄色液体渗出。治疗后冻耳肿胀逐渐消退，治疗结束（治疗4 d）后各组冻耳均已不见明显肿胀。高、中浓度胡椒供试液组治疗结束后分别有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳（冻耳表皮光滑平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样），其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、表面凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳表面有硬痂产生。高浓度胡椒供试液组治疗结束后冻耳外观评价明显好于溶剂组（P<0.01）。
3.2 冻耳治疗后病理变化
治疗后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完整，真皮水肿及炎症均明显消退，部分兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现（高浓度5只，低浓度3只），近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常（高浓度6只，中浓度4只），未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳总体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。治疗2 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中SOD活力均显着高于溶剂组（P<0.01）。治疗4 d后各组血清中SOD活力已无明显差异，但冻耳组织中SOD活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显着高于溶剂组（高浓度P<0.01，中浓度P<0.05）。治疗2 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中MDA量显着低于溶剂组（P<0.01）。治疗4 d后各组血清中MDA量均一定程度下降，与正常组相比已无明显差异，但此时冻耳组织中MDA量有差异，高、中浓度胡椒供试液组显着低于溶剂组（高浓度P<0.01，中浓度P<0.05）。治疗2 d和4 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中TNF-α量与溶剂组相比均无明显差异，但治疗4 d后冻耳组织中TNF-α量显着高于溶剂组（P<0.01）。
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1 仪器与材料
1.1 仪器
2010型酶标仪（奥地利Anthos Labtec Instruments公司）；756MC紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试药
取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24 h），合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65 g；MDA和SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20071228，20071227）；TNFα试剂盒（美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司，批号：RT110371）。
1.3 动物
日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0 kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（滇）2005-0008。
2 方法
2.1 冻伤模型复制与给药
［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6 d后将右耳耳尖至耳根7 cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。待兔耳变白变硬后再冻30 s，取出，空气中停留20 s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1 ml/次，3次/d，涂药4 d后，治疗结束。
2.2 冻耳病理检查
治疗4 d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部分，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部分剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α测定），分别在耳尖向耳根方向1，2，3 cm处取材，常规石蜡包埋，HE染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。
2.3 SOD、MDA和TNFα测定
［8］涂药2 d后，左耳中央动脉取血约4 ml。涂药4 d后心脏取血约4 ml，取“2.3”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事先盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，取出，滤纸吸干水分，称1 g耳尖部组织，用10ml预冷pH7.4的0.01 mol/L的PBS制备组织匀浆。血液与组织匀浆4℃分别以4 000 r/min和2 000 r/min离心10 min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方法测定SOD总活力、MDA与TNF-α含量。
3 结果
3.1 冻耳外观变化
复温后兔耳开始发红发热，随后变紫、肿胀、下垂。肿胀逐渐加剧，12 h后部分兔耳出现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成。24 h后肿胀程度不再增加，水泡不再增大或无新水泡形成。48 h后部分兔耳冻区有黄色液体渗出。治疗后冻耳肿胀逐渐消退，治疗结束（治疗4 d）后各组冻耳均已不见明显肿胀。高、中浓度胡椒供试液组治疗结束后分别有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳（冻耳表皮光滑平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样），其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、表面凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳表面有硬痂产生。高浓度胡椒供试液组治疗结束后冻耳外观评价明显好于溶剂组（P<0.01）。
3.2 冻耳治疗后病理变化
治疗后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完整，真皮水肿及炎症均明显消退，部分兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现（高浓度5只，低浓度3只），近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常（高浓度6只，中浓度4只），未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳总体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。治疗2 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中SOD活力均显着高于溶剂组（P<0.01）。治疗4 d后各组血清中SOD活力已无明显差异，但冻耳组织中SOD活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显着高于溶剂组（高浓度P<0.01，中浓度P<0.05）。治疗2 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中MDA量显着低于溶剂组（P<0.01）。治疗4 d后各组血清中MDA量均一定程度下降，与正常组相比已无明显差异，但此时冻耳组织中MDA量有差异，高、中浓度胡椒供试液组显着低于溶剂组（高浓度P<0.01，中浓度P<0.05）。治疗2 d和4 d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中TNF-α量与溶剂组相比均无明显差异，但治疗4 d后冻耳组织中TNF-α量显着高于溶剂组（P<0.01）。
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