黄芪香丹红花注射液对MSCs的增殖作用研究-有关优质护理服务论文
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1 材料与仪器
SD大鼠（青海地方病实验动物中心） 。淋巴细胞分离液（上海试剂二厂） ；L DMEM（Gibcobrl公司） ；胰蛋白酶（Sigma公司） ;四甲基偶氮唑（MMT） 、5 溴尿嘧啶核苷（B rdu） 、二甲基亚砜（Sigma公司） ；黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂，批准文号Z51021775），红花注射液（太原华卫药业有限公司，批准文号Z14020008），香丹注射液（四川川大华西药业股份有限公司，批准文号Z51022348） 。生物素山羊抗大鼠IgG（博士德二抗试盒） ；DAB显色剂（博士德生物工程有限公司） 。酶标仪（美国） 。
2 方法
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养取体质量200 g SD大鼠的股骨和胫骨，用DMEM冲出骨髓。将冲出的骨髓和DMEM混合液离心（1. 5 ×103 r·min- 1） 5 min，去上清液后，用DMEM制成悬液。用吸管沿管壁将悬液慢慢加入已装有4 ml分离液的离心管中，使两种溶液间有明显的界面， 1.9 ×103 r·min- 1水平离心20 min。用吸管小心吸取中层白色雾状的细胞层，无血清DMEM液洗涤两次，然后用含15%小牛血清的DMEM培养液重悬， 5 ×105·ml- 1接种， 37℃、5%CO2 孵箱培养。第5天，第1次换液，此后每7 d换液两次。
2.2 加药培养待细胞接近融合时，按1 ×104·ml- 1传代，传至第3代时，将细胞浓度调为2 ×105·ml- 1 ，接种于96孔板（每孔100 μl） ，培养24 h；吸去上清液，每孔加不含血清的DMEM溶液100 μl，培养24 h；吸去上清液，每孔加100 μl含15%小牛血清的DMEM培养液，同时分别加入黄芪、红花、香丹注射液（药物浓度梯度为：原液，5，10，15，20倍液）每孔70 μl，每个浓度3个重复孔。3个阴性对照孔加等量的生理盐水，培养24，48 h，用MTT法检测3种注射液和生理盐水对细胞的增殖作用。MTT检测24，48 h后，吸去培养液，每孔加20μlMTT溶液孵育4 h，吸出MTT；再加入200 μl二甲基亚砜，用酶联检测仪于490 nm测定吸光度。结果见表1。
2.3 细胞爬片的制备将细胞浓度调整为2×105/ml，接种与预先放有玻片的24孔板（1 ml/孔），培养24 h后，将上清吸去，加不含血清的DMEM溶液1ml/孔，培养24 h后，吸去上清，每孔加0.59 ml含15%胎牛血清的DMEM培养液以及Brdu，同时加入黄芪注射液、红花注射液、香丹注射液（浓度梯度为：原液，5，10，15，20倍）各0.41 ml/孔，对照组加0.41ml/孔的生理盐水，1个浓度3个重复孔。使每孔Brdu的终浓度为10 μg/ml。
2.4 Brdu表达的检测培养48 h后，吸去培养液，用 Carnoy液固定细胞10，自然干燥。3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min。5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加适当稀释的Brdu抗体（1∶200），37℃孵育2 h，PBS冲洗，5 min×3次。滴加生物素人抗大鼠IgG，37℃孵育20 min。PBS冲洗，5 min×3次。DAB显色 5 min 每张片镜下随机选取10个视野计数阳性细胞数，取平均值。统计学分析本实验所有计量资料以±s表示，显着性检验采用方差分析，组间比较采用几个处理组均数与一个对照组均数比较的Dunnett法。在本实验中，我们用黄芪、红花注射液体外培养MSCs，未发现这两种注射液对MSCs的增殖有促进作用。
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SD大鼠（青海地方病实验动物中心） 。淋巴细胞分离液（上海试剂二厂） ；L DMEM（Gibcobrl公司） ；胰蛋白酶（Sigma公司） ;四甲基偶氮唑（MMT） 、5 溴尿嘧啶核苷（B rdu） 、二甲基亚砜（Sigma公司） ；黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂，批准文号Z51021775），红花注射液（太原华卫药业有限公司，批准文号Z14020008），香丹注射液（四川川大华西药业股份有限公司，批准文号Z51022348） 。生物素山羊抗大鼠IgG（博士德二抗试盒） ；DAB显色剂（博士德生物工程有限公司） 。酶标仪（美国） 。
2 方法
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养取体质量200 g SD大鼠的股骨和胫骨，用DMEM冲出骨髓。将冲出的骨髓和DMEM混合液离心（1. 5 ×103 r·min- 1） 5 min，去上清液后，用DMEM制成悬液。用吸管沿管壁将悬液慢慢加入已装有4 ml分离液的离心管中，使两种溶液间有明显的界面， 1.9 ×103 r·min- 1水平离心20 min。用吸管小心吸取中层白色雾状的细胞层，无血清DMEM液洗涤两次，然后用含15%小牛血清的DMEM培养液重悬， 5 ×105·ml- 1接种， 37℃、5%CO2 孵箱培养。第5天，第1次换液，此后每7 d换液两次。
2.2 加药培养待细胞接近融合时，按1 ×104·ml- 1传代，传至第3代时，将细胞浓度调为2 ×105·ml- 1 ，接种于96孔板（每孔100 μl） ，培养24 h；吸去上清液，每孔加不含血清的DMEM溶液100 μl，培养24 h；吸去上清液，每孔加100 μl含15%小牛血清的DMEM培养液，同时分别加入黄芪、红花、香丹注射液（药物浓度梯度为：原液，5，10，15，20倍液）每孔70 μl，每个浓度3个重复孔。3个阴性对照孔加等量的生理盐水，培养24，48 h，用MTT法检测3种注射液和生理盐水对细胞的增殖作用。MTT检测24，48 h后，吸去培养液，每孔加20μlMTT溶液孵育4 h，吸出MTT；再加入200 μl二甲基亚砜，用酶联检测仪于490 nm测定吸光度。结果见表1。
2.3 细胞爬片的制备将细胞浓度调整为2×105/ml，接种与预先放有玻片的24孔板（1 ml/孔），培养24 h后，将上清吸去，加不含血清的DMEM溶液1ml/孔，培养24 h后，吸去上清，每孔加0.59 ml含15%胎牛血清的DMEM培养液以及Brdu，同时加入黄芪注射液、红花注射液、香丹注射液（浓度梯度为：原液，5，10，15，20倍）各0.41 ml/孔，对照组加0.41ml/孔的生理盐水，1个浓度3个重复孔。使每孔Brdu的终浓度为10 μg/ml。
2.4 Brdu表达的检测培养48 h后，吸去培养液，用 Carnoy液固定细胞10，自然干燥。3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min。5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加适当稀释的Brdu抗体（1∶200），37℃孵育2 h，PBS冲洗，5 min×3次。滴加生物素人抗大鼠IgG，37℃孵育20 min。PBS冲洗，5 min×3次。DAB显色 5 min 每张片镜下随机选取10个视野计数阳性细胞数，取平均值。统计学分析本实验所有计量资料以±s表示，显着性检验采用方差分析，组间比较采用几个处理组均数与一个对照组均数比较的Dunnett法。在本实验中，我们用黄芪、红花注射液体外培养MSCs，未发现这两种注射液对MSCs的增殖有促进作用。
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