探讨EBV和HHV6感染在药疹发生中的作用 河南文化小论文
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药疹又称为药物性皮炎，轻者仅有皮疹，重者可并发肝、肾、肺、心血管以及血液系统等损害。药疹的发病机制比较复杂，影响药疹发病的因素决定了药疹的发生、临床表现和转归。近年来药疹的病毒感染因素受到高度重视，活动性病毒感染可改变机体的免疫调节功能，提高免疫系统的免疫敏感性。研究表明，潜在的病毒感染可以启动或激活药物诱导的超敏反应。人疱疹病毒6型（HHV6）和 EB病毒（EBV）均为嗜淋巴细胞疱疹病毒，可在体内形成潜伏感染，一定条件下可被激活，造成免疫功能紊乱，可能在药物超敏反应综合征中起着重要的作用[1,2]。本研究旨在探讨EBV和HHV 6感染在药疹发生中的作用以及两者间的相互关系。
1 对象与方法
1.1 对象
药疹病人31例，其中男16例，女15例，平均年龄(42.48±15.46)岁，全部病人均有明确的服药史，在服药2～19 d（平均4.94 d）后出现皮疹，均符合药疹的诊断和分型标准[3]。选择同期健康献血员148例作为对照组，其中男81例，女67例，平均年龄 （42.12±15.04）岁，两组性别和年龄差异无统计学意义。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 取4 mL静脉血EDTA抗凝后梯度离心法分离外周血单个核细胞，用酚 氯仿 异戊醇抽提法提取细胞DNA，TRIZol一步法提取细胞总RNA，定量备用。
1.2.2 引物和探针的设计合成 参考文献[4～6]设计检测EBV 和HHV6 基因组以及EBV即刻早期基因BZLF1 mRNA的特异性引物，由大连宝生物工程有限公司合成，引物和探针序列见表1。表1 PCR检测用引物和探针序列引物序列
1.2.3 巢式PCR（Nested PCR）检测HHV6 DNA采用巢式PCR检测HHV6 DNA，外侧PCR反应体积为25 μL，反应体系包括10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0 U，DNA 模板4 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min。以外侧引物的PCR产物为模板进行内侧PCR扩增反应，内侧PCR反应体积25 μL，反应体系包括10×Buffer 3 μL，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，4×dNTP为0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，内侧引物浓度0.5 μmol/L，外侧PCR产物2 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃变性 30 s，56℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取8 μL内侧PCR产物于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察电泳结果，外侧PCR扩增产物长为287 bp，内侧PCR扩增产物长为163 bp，同时以HHV6 GS株为阳性对照，阴性对照为HHV6阴性J Jhan细胞系。
1.2.4 HHV6的PCR产物酶切分型 取HHV6内侧PCR阳性扩增产物（163 bp）用限制性内切酶HindⅢ进行酶切分析。反应体积为20 μL，反应体系包括10×Buffer 2 μL，PCR产物10 μL，HindⅢ10 U，去离子水补充体积至20 μL，置37 ℃水浴消化12～16 h。取酶切产物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳（80 V，90 min），凝胶用溴化乙锭（0.5 mg/L）染色20 min，凝胶成像系统观察电泳结果。
1.2.5 EBV VCA IgM抗体检测 采集受检者外周血的分离血清，采用ELISA法检测EBV衣壳抗原（VCA）特异性IgM 抗体，诊断试剂盒购自德国NOVATEC公司。具体方法参照试剂盒说明进行，对阳性标本进行重复实验。
1.2.6 PCR Southern检测EBV DNA PCR反应总体积为25 μL，反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0 U，DNA 模板3 μL，同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为EBV 阳性细胞系B95 8，阴性对照为EBV 阴性细胞系Ramos 细胞。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，共扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取扩增产物10 μL以20 g/L琼脂糖凝胶电泳后转印到尼龙膜上，与地高辛标记的寡核苷酸探针进行杂交反应，经碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体作用后，加酶的发光底物CSPD 作用5 min，自显影检测杂交信号。
1.2.7 RT PCR Southern法检测BZLF1 mRNA取1 μg制备的总RNA，按逆转录试剂盒要求（美国Promega公司）合成cDNA作为PCR反应的模板。PCR阳性对照为EBV阳性的淋巴母细胞系细胞，阴性对照为EBV阴性Ramos细胞系。取PCR扩增产物电泳后转膜进行膜上杂交，方法同上。
1.2.8 统计学方法 采用SPSS软件进行统计处理，组间比较采用四格表χ2检验及精确概率法。
2 结 果
2.1 EBV DNA和HHV6 DNA检测
药疹病人EBV DNA阳性率为77.42%（24/31），对照组为9.46%（14/148），两组比较差异有显著性（χ2=77.84，P<0.01）。部分药疹病人Southern blotting的检测结果见图1。药疹病人HHV6 DNA阳性率为32.62%(10/31)，对照组为49.32%（73/148），两组比较差异无显著性（χ2=3.00，P>0.05）。
2.2 HHV6 PCR产物的限制性酶切分析
HHV6内侧PCR产物大小为163 bp，酶切产物电泳后若观察到长66 bp和97 bp两条带者为6A亚型；而HHV6 B则不被Hind Ⅲ消化，仍为长163 bp的内侧PCR扩增产物条带，图2为HHV6阳性标本PCR产物酶切后电泳结果。10例HHV6阳性的药疹病人全部为HHV6A亚型，未检测到HHV6B亚型；而正常对照组73例HHV6阳性标本中有13例为HHV6A亚型(13/73)。
2.3 EBV增殖期基因表达和HHV6感染的相关性分析
本文EBV DNA阳性药疹病人中有5例检测出BZLF1 mRNA，其中4例为HHV6 DNA阳性。EBV阳性药疹病人BZLF1 mRNA和HHV6检出率呈明显的正相关性（r=0.45，P<0.05）。
2.4 EBV VCA IgM抗体检测
本文31例药疹病人中有6例VCA IgM阳性，阳性率为19.34%，用单纯随机抽样方法选取的30例正常对照，未检测到EBV VCA IgM，两组比较差异有显著性（χ2=4.61，P<0.01）。
3 讨 论
药疹是一类由某种药物引起的严重不良反应，通常药物治疗后2～5周出现症状，病人可伴有发热、淋巴结大、嗜红细胞和非特异性淋巴细胞增多、肝炎以及多器官衰竭[6]。药疹的发生、临床表现和转归受多方面因素的制约，病毒感染与药物的相互作用是一些医源性疾病的主要发病机制之一。有研究表明，病毒感染可提高药疹的危险度。HHV6是急性发热性玫瑰疹病的致病因素，90%以上的2岁以下儿童原发感染，随后病毒通常以潜伏的形式存在宿主体内，当宿主免疫功能受到抑制时会被重新激活。婴儿期的原发EBV感染大多数没有症状，50%左右成人的原发感染以传染性单核细胞增多症的形式出现。本文的研究结果表明，药疹病人EBV DNA 和VCA IgM的阳性率均明显高于正常对照组，表明EBV感染与药疹的发生密切相关。通常认为EBV特异性IgM抗体检出则提示存在原发性或活动性EBV感染，本研究中6例药疹病人VCA IgM阳性，对照组则均为阴性，提示药疹病人存在EBV活动性感染。而EBV DNA的检出率高于VCA IgM的检出率，推测一方面病毒由潜伏状态转为活动性感染，造成机体免疫功能紊乱所致；另一方面本研究多数病人一般在用药5 d左右出现症状并采集标本，此时可能EBV 特异性IgM的抗体效价较低。因此，我们对药疹病人标本中病毒DNA载量进行检测，并动态监测病人血清VCA IgM抗体变化，以确定药疹病人病毒感染状态。临床上由于使用抗生素而导致传染性单核细胞增多症病人药疹发作较为常见，LECLAIRE等[8]也报道，传染性单核细胞增多症病人使用阿莫西林常导致药疹发作。在非洲淋巴瘤EBV感染病人，其药物变态反应的发生率明显升高，而感染缓解后使用相同的药物不会导致超敏反应的发生[9]。
EBV和HHV6均为嗜淋巴细胞疱疹病毒，都可在体内潜伏感染。SHIOHARA等[10]报道，疱疹病毒激活在药疹的发病过程中起着重要的作用，病毒活化刺激机体产生强烈的免疫反应，从而出现严重的临床症状。体外实验已经证实，EBV阳性的淋巴细胞系感染HHV6后可以使此细胞中EBV活化[11]。EBV即刻早期基因BZLF1是病毒基因组从潜伏状态活化进入增殖期后最早表达的基因，其产生不依赖于其他病毒蛋白的合成。本研究结果显示，24例EBV DNA阳性药疹病人中有5例检测到BZLF1 mRNA，其中4例为HHV6阳性，HHV6检出率与BZLF1 mRNA有明显相关性，提示两种病毒在药疹发生中可能存在协同作用。FLAMAND等也证实，HHV6感染B细胞后可导致BZLF1编码蛋白Zebra合成增加，Zebra是EBV由潜伏期进入裂解期的关键蛋白，进而活化EBV下游早期基因，通过一系列级联反应使病毒进入裂解期。因此，我们推测药疹病人EBV和HHV6的联合感染可以促使EBV进入裂解期，激发机体免疫反应，加速其发病进程。
HHV6根据毒株的抗原性、感染宿主的范围、限制性核酸内切图谱以及序列分析等特点，可以分为HHV6A和HHV6B。HHV6的A、B两个亚型广泛存在于健康成人及儿童PBMC和唾液中，但在不同疾病中的流行情况有所不同。HHV 6原发感染多为B亚型所致，在幼儿急症和骨髓移植病人中主要为B亚型，而在艾滋病及淋巴增生性疾病的病人中，A亚型的检出率则远高于B亚型[12]。令人感兴趣的是，本研究10例HHV6阳性标本药疹病人检出的均为HHV6A，迄今为止未发现有相似的报道，其具体机制还需进一步研究。
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药疹又称为药物性皮炎，轻者仅有皮疹，重者可并发肝、肾、肺、心血管以及血液系统等损害。药疹的发病机制比较复杂，影响药疹发病的因素决定了药疹的发生、临床表现和转归。近年来药疹的病毒感染因素受到高度重视，活动性病毒感染可改变机体的免疫调节功能，提高免疫系统的免疫敏感性。研究表明，潜在的病毒感染可以启动或激活药物诱导的超敏反应。人疱疹病毒6型（HHV6）和 EB病毒（EBV）均为嗜淋巴细胞疱疹病毒，可在体内形成潜伏感染，一定条件下可被激活，造成免疫功能紊乱，可能在药物超敏反应综合征中起着重要的作用[1,2]。本研究旨在探讨EBV和HHV 6感染在药疹发生中的作用以及两者间的相互关系。
1 对象与方法
1.1 对象
药疹病人31例，其中男16例，女15例，平均年龄(42.48±15.46)岁，全部病人均有明确的服药史，在服药2～19 d（平均4.94 d）后出现皮疹，均符合药疹的诊断和分型标准[3]。选择同期健康献血员148例作为对照组，其中男81例，女67例，平均年龄 （42.12±15.04）岁，两组性别和年龄差异无统计学意义。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 取4 mL静脉血EDTA抗凝后梯度离心法分离外周血单个核细胞，用酚 氯仿 异戊醇抽提法提取细胞DNA，TRIZol一步法提取细胞总RNA，定量备用。
1.2.2 引物和探针的设计合成 参考文献[4～6]设计检测EBV 和HHV6 基因组以及EBV即刻早期基因BZLF1 mRNA的特异性引物，由大连宝生物工程有限公司合成，引物和探针序列见表1。表1 PCR检测用引物和探针序列引物序列
1.2.3 巢式PCR（Nested PCR）检测HHV6 DNA采用巢式PCR检测HHV6 DNA，外侧PCR反应体积为25 μL，反应体系包括10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0 U，DNA 模板4 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min。以外侧引物的PCR产物为模板进行内侧PCR扩增反应，内侧PCR反应体积25 μL，反应体系包括10×Buffer 3 μL，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，4×dNTP为0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，内侧引物浓度0.5 μmol/L，外侧PCR产物2 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃变性 30 s，56℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取8 μL内侧PCR产物于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察电泳结果，外侧PCR扩增产物长为287 bp，内侧PCR扩增产物长为163 bp，同时以HHV6 GS株为阳性对照，阴性对照为HHV6阴性J Jhan细胞系。
1.2.4 HHV6的PCR产物酶切分型 取HHV6内侧PCR阳性扩增产物（163 bp）用限制性内切酶HindⅢ进行酶切分析。反应体积为20 μL，反应体系包括10×Buffer 2 μL，PCR产物10 μL，HindⅢ10 U，去离子水补充体积至20 μL，置37 ℃水浴消化12～16 h。取酶切产物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳（80 V，90 min），凝胶用溴化乙锭（0.5 mg/L）染色20 min，凝胶成像系统观察电泳结果。
1.2.5 EBV VCA IgM抗体检测 采集受检者外周血的分离血清，采用ELISA法检测EBV衣壳抗原（VCA）特异性IgM 抗体，诊断试剂盒购自德国NOVATEC公司。具体方法参照试剂盒说明进行，对阳性标本进行重复实验。
1.2.6 PCR Southern检测EBV DNA PCR反应总体积为25 μL，反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0 U，DNA 模板3 μL，同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为EBV 阳性细胞系B95 8，阴性对照为EBV 阴性细胞系Ramos 细胞。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，共扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取扩增产物10 μL以20 g/L琼脂糖凝胶电泳后转印到尼龙膜上，与地高辛标记的寡核苷酸探针进行杂交反应，经碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体作用后，加酶的发光底物CSPD 作用5 min，自显影检测杂交信号。
1.2.7 RT PCR Southern法检测BZLF1 mRNA取1 μg制备的总RNA，按逆转录试剂盒要求（美国Promega公司）合成cDNA作为PCR反应的模板。PCR阳性对照为EBV阳性的淋巴母细胞系细胞，阴性对照为EBV阴性Ramos细胞系。取PCR扩增产物电泳后转膜进行膜上杂交，方法同上。
1.2.8 统计学方法 采用SPSS软件进行统计处理，组间比较采用四格表χ2检验及精确概率法。
2 结 果
2.1 EBV DNA和HHV6 DNA检测
药疹病人EBV DNA阳性率为77.42%（24/31），对照组为9.46%（14/148），两组比较差异有显著性（χ2=77.84，P<0.01）。部分药疹病人Southern blotting的检测结果见图1。药疹病人HHV6 DNA阳性率为32.62%(10/31)，对照组为49.32%（73/148），两组比较差异无显著性（χ2=3.00，P>0.05）。
2.2 HHV6 PCR产物的限制性酶切分析
HHV6内侧PCR产物大小为163 bp，酶切产物电泳后若观察到长66 bp和97 bp两条带者为6A亚型；而HHV6 B则不被Hind Ⅲ消化，仍为长163 bp的内侧PCR扩增产物条带，图2为HHV6阳性标本PCR产物酶切后电泳结果。10例HHV6阳性的药疹病人全部为HHV6A亚型，未检测到HHV6B亚型；而正常对照组73例HHV6阳性标本中有13例为HHV6A亚型(13/73)。
2.3 EBV增殖期基因表达和HHV6感染的相关性分析
本文EBV DNA阳性药疹病人中有5例检测出BZLF1 mRNA，其中4例为HHV6 DNA阳性。EBV阳性药疹病人BZLF1 mRNA和HHV6检出率呈明显的正相关性（r=0.45，P<0.05）。
2.4 EBV VCA IgM抗体检测
本文31例药疹病人中有6例VCA IgM阳性，阳性率为19.34%，用单纯随机抽样方法选取的30例正常对照，未检测到EBV VCA IgM，两组比较差异有显著性（χ2=4.61，P<0.01）。
3 讨 论
药疹是一类由某种药物引起的严重不良反应，通常药物治疗后2～5周出现症状，病人可伴有发热、淋巴结大、嗜红细胞和非特异性淋巴细胞增多、肝炎以及多器官衰竭[6]。药疹的发生、临床表现和转归受多方面因素的制约，病毒感染与药物的相互作用是一些医源性疾病的主要发病机制之一。有研究表明，病毒感染可提高药疹的危险度。HHV6是急性发热性玫瑰疹病的致病因素，90%以上的2岁以下儿童原发感染，随后病毒通常以潜伏的形式存在宿主体内，当宿主免疫功能受到抑制时会被重新激活。婴儿期的原发EBV感染大多数没有症状，50%左右成人的原发感染以传染性单核细胞增多症的形式出现。本文的研究结果表明，药疹病人EBV DNA 和VCA IgM的阳性率均明显高于正常对照组，表明EBV感染与药疹的发生密切相关。通常认为EBV特异性IgM抗体检出则提示存在原发性或活动性EBV感染，本研究中6例药疹病人VCA IgM阳性，对照组则均为阴性，提示药疹病人存在EBV活动性感染。而EBV DNA的检出率高于VCA IgM的检出率，推测一方面病毒由潜伏状态转为活动性感染，造成机体免疫功能紊乱所致；另一方面本研究多数病人一般在用药5 d左右出现症状并采集标本，此时可能EBV 特异性IgM的抗体效价较低。因此，我们对药疹病人标本中病毒DNA载量进行检测，并动态监测病人血清VCA IgM抗体变化，以确定药疹病人病毒感染状态。临床上由于使用抗生素而导致传染性单核细胞增多症病人药疹发作较为常见，LECLAIRE等[8]也报道，传染性单核细胞增多症病人使用阿莫西林常导致药疹发作。在非洲淋巴瘤EBV感染病人，其药物变态反应的发生率明显升高，而感染缓解后使用相同的药物不会导致超敏反应的发生[9]。
EBV和HHV6均为嗜淋巴细胞疱疹病毒，都可在体内潜伏感染。SHIOHARA等[10]报道，疱疹病毒激活在药疹的发病过程中起着重要的作用，病毒活化刺激机体产生强烈的免疫反应，从而出现严重的临床症状。体外实验已经证实，EBV阳性的淋巴细胞系感染HHV6后可以使此细胞中EBV活化[11]。EBV即刻早期基因BZLF1是病毒基因组从潜伏状态活化进入增殖期后最早表达的基因，其产生不依赖于其他病毒蛋白的合成。本研究结果显示，24例EBV DNA阳性药疹病人中有5例检测到BZLF1 mRNA，其中4例为HHV6阳性，HHV6检出率与BZLF1 mRNA有明显相关性，提示两种病毒在药疹发生中可能存在协同作用。FLAMAND等也证实，HHV6感染B细胞后可导致BZLF1编码蛋白Zebra合成增加，Zebra是EBV由潜伏期进入裂解期的关键蛋白，进而活化EBV下游早期基因，通过一系列级联反应使病毒进入裂解期。因此，我们推测药疹病人EBV和HHV6的联合感染可以促使EBV进入裂解期，激发机体免疫反应，加速其发病进程。
HHV6根据毒株的抗原性、感染宿主的范围、限制性核酸内切图谱以及序列分析等特点，可以分为HHV6A和HHV6B。HHV6的A、B两个亚型广泛存在于健康成人及儿童PBMC和唾液中，但在不同疾病中的流行情况有所不同。HHV 6原发感染多为B亚型所致，在幼儿急症和骨髓移植病人中主要为B亚型，而在艾滋病及淋巴增生性疾病的病人中，A亚型的检出率则远高于B亚型[12]。令人感兴趣的是，本研究10例HHV6阳性标本药疹病人检出的均为HHV6A，迄今为止未发现有相似的报道，其具体机制还需进一步研究。
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