升压宁对一氧化氮合酶iNOS的表达抑制作用研究-糖尿病护理论文

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1 材料与仪器
　　1.1 动物健康SD雄性大鼠46只，体质量220～250 g，由四川省中药研究所提供。
　　1.2 药物中药升压宁制成每毫升含1 g生药浓度，高温灭菌后4℃冰箱保存备用。阳性药地塞米松注射液，1    ml:5 mg/支，由西南药业股份有限公司生产。
　　1.3 试剂与仪器
　　内毒素（LPS，O55:B5，Sigma公司产品）；TNF-α试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所）；iNOS试剂盒（美国Santa Cruz Biotechnology公司产品）。多导生理记录仪（日本光电），BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），电热恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。
　　2 方法
　　2.1   动物分组及处理
　　动物随机分为4组：空白对照组、休克模型组、升压宁组、阳性对照组。空白对照组10只，其余各组每组12只。处理如下：休克模型组（LPS组），将LPS经尾静脉按10 mg/kg一次性注入；升压宁组（LPS+SYN组），于造模前5天按成人等效剂量给予升压宁灌胃，10 g/kg，1次/d，连续5 d，并于造模（即注入LPS）10 min后，再十二指肠给予升压宁1次；阳性对照组（LPS+DSMS组），于术前10 min尾静脉注入地塞米松（2 mg/kg）葡萄糖溶液5 ml/kg。空白对照组，在各相同时间点注入等量生理盐水。
　　2.2 动物模型制作
　　参照马超英［3］的造模方法，实验前打开BL-420E+生物机能实验系统。将SD大鼠用3％戊巴比妥钠溶液按0.15 ml/kg腹腔麻醉，仰卧固定于手术台，无菌操作下分离右侧颈总动脉，远心端用0号丝线结扎，近心端做一小切口插入肝素化硅胶管，0号丝线结扎固定以防滑脱，肝素化硅胶管另一端经压力传感器与BL-420E+生物机能实验系统端口相连记录血压。待动物血压、呼吸频率、心率平稳后（约15 min），除空白组外，其余各组均经尾静脉按10 mg/kg注入LPS，3 min缓慢推完，复制内毒素休克模型，空白组注入等量生理盐水。注入内毒素后，动态记录2 h内的血压变化。
　　2.3 标本制备注入内毒素2 h后，股动脉放血处死动物，打开腹腔，用无菌手术剪剪取全肝，以4％多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，切片（片厚3 μm或5 μm），其中取3 μm厚的组织片进行HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织形态学变化；取5 μm厚的组织片，进行免疫组化染色，检测肝组织中TNF-α和iNOS水平。
　　3 结果
　　光镜下观察肝组织HE染色后形态：空白对照组，肝细胞排列整齐，肝窦结构清楚。休克模型组肝细胞呈灶性坏死或弥漫性大片状坏死，肝窦结构被破坏，汇管区可见大量炎细胞浸润；各治疗组肝脏病理改变较休克模型组明显减轻，肝细胞见点状坏死，肝汇管区有少量炎细胞浸润。结果表明，与空白对照组比较，休克模型组的TNF-α阳性表达平均积分光密度和累积积分光密度均极显着增强（P0.01）；与休克模型组比较，各治疗组经治疗后均能显着下调肝组织TNF-α的过度表达，其中生脉组与模型组比较差异显着（P0.05），阳性组、升压宁组和小蓟组与模型组比较差异极其显着（P0.01）；与阳性对照组比较，升压宁组、生脉组和小蓟组肝组织TNF-α的表达水平均无显着差异（P0.05）；与升压宁组比较，生脉组和小蓟组TNF-α的表达水平均无显着差异（P0.05）。
　　与空白对照组比较，休克模型组的iNOS阳性表达平均积分光密度和累积积分光密度均显着增强（P0.01），而阳性对照组和升压宁组的阳性表达iNOS平均积分光密度和累积积分光密度与空白组比较无显着差异（P0.05）；与休克模型组比较，各治疗组经治疗后均能显着抑制肝组织iNOS的过度表达（P0.01）；与阳性对照组比较，升压宁组、生脉组和小蓟组肝组织iNOS的表达水平均无显着差异（P0.05）；与升压宁组比较，生脉组和小蓟组iNOS的表达水平均无显着差异（P0.05）。本研究结果表明，休克模型组肝组织中的iNOS阳性表达水平较空白对照组显着升高，而升压宁组的iNOS阳性表达水平显着降低，说明其对iNOS的表达具有抑制作用。iNOS是合成对细胞主要发挥细胞毒作用的高水平NO的关键酶，升压宁通过对炎性酶iNOS表达的抑制，从而减少高水平的NO对细胞的细胞毒作用，及NO自由基对受感染机体的细胞及组织造成的损伤。
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