薰衣草精油的制备与药性活力研究-糖尿病个案护理论文
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1 仪器及材料
超临界CO2萃取仪（南通华安超临界萃取设备有限公司）；多功能酶标仪（Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH）；AR-2140型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司制造）。薰衣草花（新疆农四师六十三团）；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（Sigma公司）；Tris（北京拜尔迪生物公司）；2-硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（天津市富宇精细化工有限公司）；氢过氧化枯烯（Sigma公司）。
2 方法
2.1 薰衣草精油的制备
2.1.1 水蒸气蒸馏法提取
精油称取80 g薰衣草花穗粉末，浸泡1 h后，置于1 000 ml三口烧瓶中，一口连接水蒸气发生装置，另一口连接直型冷凝管，冷凝管接油水分离器。水蒸气通入烧瓶，从有馏出液滴出开始计时，通过油水分离器分出下层水分，3 h后停止蒸馏，收集精油。将数次实验所得精油合并，加入无水Na2SO4 除去水分后称量并计算得率，冷藏。
2.1.2 超临界CO2萃取法提取
精油薰衣草花穗粉末装入萃取罐中，在解析压力为6.5×103 kPa,萃取压力为22×103 kPa ,温度为45 ℃，以20 L/h的流量通入CO2，萃取120 min后，从解析罐中放出精油。 将数次实验所得精油合并，称量并计算得率，冷藏。
2.1.3 薰衣草精油得率的计算
薰衣草精油得率（%）=［萃取出的薰衣草精油质量（g）］/［原料质量（g）］×100%
2.2 DPPH·清除能力测定
向100 μl DPPH·乙醇溶液（浓度为0.1 mmol/L）中加入不同浓度的薰衣草精油及无水乙醇使总体积达到200 μl。振荡器混匀后，室温，避光放置30 min后，在517 nm处测定吸光度，平行测定3 次，计算清除率。
DPPH·清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%
式中：A0为DPPH·溶液100 μl加无水乙醇100 μl的吸光度；A1为DPPH·溶液100 μl加样品溶液100 μl的吸光度；A2为样品溶液100 μl加无水乙醇100 μl的吸光度。公式中引入A2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。
2.3 ·OH清除能力测定
损伤管：30 μl 0.75 mmol/L邻二氮菲无水溶液中加入60 μl 0.15 M的PBS（pH=7.4），加入30 μl的蒸馏水，充分混匀后，加入30 μl 0.75 mmol/L的硫酸亚铁，混匀后，再加入30 μl的1%的H2O2混匀。37℃的水浴中60 min后，在536 nm处，测定吸光度为A损；未损伤管：以30 μl的蒸馏水代替H2O2重复上述操作，在536 nm处，测定吸光度为A未损；样品管：以30 μl的样品代替30 μl的蒸馏水重复损伤管组操作，在536 nm处，测定吸光度为A样；样品参比：60 μl 0.15mol/L的PBS中加30 μl的样品，充分混匀后，加入90 μl的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为A参；空白参比：60 μl 0.15 mol/L的PBS加入120 μl的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为A空。
·OH清除率（%）=［（A样-A参-A损+A空）/（A未损- A损）］×100%
2.4 超氧阴离子生成抑制能力测定
取浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl（pH=8.2）缓冲液100 μl，25 ℃预热20 min后，加入 50 μl不同浓度的薰衣草精油，立即加入40 μl的3 mmol/L的邻苯三酚，振荡使之充分反应，4 min后，用10 μl的3 mol/L的HCl终止反应，在325 nm处测定吸光度（A1），平行测定3次。模型对照组（A0）用50 μl的蒸馏水代替样品液。空白对照组（A2）用40 μl的蒸馏水代替邻苯三酚。
O-2· 抑制率（%）=［（A0-A1+ A2）/A0］×100%
2.5 卵黄脂质过氧化抑制能力测定
卵黄悬液的配制：卵黄用等体积的pH=7.4的0.1 M PBS配成1∶1悬液，并用磁力搅拌器搅拌10 min（置于冰箱中4℃）备用，使用前用PBS稀释成1∶25的悬液。吸取1∶25的卵黄悬液20 μl,加入20 μl的不用浓度的薰衣草精油，再加入20 μl的25 mmol/L的FeSO4，用pH=7.4，0.1 mol/L的PBS补至200 μl,37℃振荡15 min，取出后再加入50 μl的20%的三氯乙酸，4 000 r/min离心8 min，吸取100 μl上清液加入50 μl 0.8% TBA，封口，沸水浴中煮15 min，在532 nm处测吸光度，平行测定3次。以不加样品管的吸光度为A0。以样品加PBS管的吸光度为A样。
抑制率（%）=［（A0-A+A样）/A0］×100%
2.6 红细胞溶血实验
取新鲜大鼠血液，加入备有肝素钠的离心管中，制成抗凝血，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，用PBS（pH=7.4） 洗涤，3 000 r/min离心10 min，重复2次，得到压积红细胞，以PBS（pH=7.4）将压积红细胞配成2.5%混悬液。各取100 μl2.5%红细胞悬液，加入不同浓度样品溶液50 μl，加入100 μl的0.5 mmol/L氢过氧化枯烯，37 ℃温孵3.5 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液测定OD710（A）；取100 μl的红细胞加50 μl的PBS,100 μl的蒸馏水，作为完全溶血的对照，同样处理，测定 OD710 （B）。按公式 （A/B） ×100 %计算溶血的变化。
3 结果
3.1 薰衣草精油的外观状态与得率水蒸气蒸馏法制备的薰衣草精油为微黄色澄清油状液体，香气柔和，得率在0.7%～0.9%。超临界CO2萃取法制备的薰衣草精油为深黄色微浑浊油状液体，香气较浓烈，近似真花香，得率在3.1%～4.2%。·OH清除能力测定Fenton反应产生的羟自由基使邻二氮菲吸光度降低，清除剂清除·OH，吸光度升高，利用反应前后吸光度值A的变化来测定清除率。从图2可得知，两种方法提取的薰衣草精油具有一定的清除·OH的能力，且呈剂量依赖关系。t检验表明，超临界CO2萃取法提取的薰衣草精油清除·OH能力较强，与水蒸气蒸馏法提取的精油之间的抗氧化能力差异显着（P＜0.01）。
超氧阴离子清除能力测定在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成O -2·和有色中间产物，该有色物质在325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时，O -2·的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在325 nm处的吸光度减小。故通过测定A325值可以定量计算出清除剂的清除率。实验结果（见图3）表明，两种方法提取的薰衣草精油对超氧阴离子的生成均有抑制作用，且作用随着剂量的增加而增强。超临界CO2萃取法提取的薰衣草精油作用较强，EC50为60.5 mg/L；水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油作用较弱，EC50为72.5 mg/L，差异具有统计学意义（P＜0.01）。薰衣草精油具有良好的开发和应用价值，超临界CO2萃取薰衣草精油技术值得开展产业化研究。但薰衣草精油有效成分与抗氧化活性之间的关系，以及在抗氧化体系中的分子机制等还有待进一步的研究。
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1 仪器及材料
超临界CO2萃取仪（南通华安超临界萃取设备有限公司）；多功能酶标仪（Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH）；AR-2140型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司制造）。薰衣草花（新疆农四师六十三团）；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（Sigma公司）；Tris（北京拜尔迪生物公司）；2-硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（天津市富宇精细化工有限公司）；氢过氧化枯烯（Sigma公司）。
2 方法
2.1 薰衣草精油的制备
2.1.1 水蒸气蒸馏法提取
精油称取80 g薰衣草花穗粉末，浸泡1 h后，置于1 000 ml三口烧瓶中，一口连接水蒸气发生装置，另一口连接直型冷凝管，冷凝管接油水分离器。水蒸气通入烧瓶，从有馏出液滴出开始计时，通过油水分离器分出下层水分，3 h后停止蒸馏，收集精油。将数次实验所得精油合并，加入无水Na2SO4 除去水分后称量并计算得率，冷藏。
2.1.2 超临界CO2萃取法提取
精油薰衣草花穗粉末装入萃取罐中，在解析压力为6.5×103 kPa,萃取压力为22×103 kPa ,温度为45 ℃，以20 L/h的流量通入CO2，萃取120 min后，从解析罐中放出精油。 将数次实验所得精油合并，称量并计算得率，冷藏。
2.1.3 薰衣草精油得率的计算
薰衣草精油得率（%）=［萃取出的薰衣草精油质量（g）］/［原料质量（g）］×100%
2.2 DPPH·清除能力测定
向100 μl DPPH·乙醇溶液（浓度为0.1 mmol/L）中加入不同浓度的薰衣草精油及无水乙醇使总体积达到200 μl。振荡器混匀后，室温，避光放置30 min后，在517 nm处测定吸光度，平行测定3 次，计算清除率。
DPPH·清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%
式中：A0为DPPH·溶液100 μl加无水乙醇100 μl的吸光度；A1为DPPH·溶液100 μl加样品溶液100 μl的吸光度；A2为样品溶液100 μl加无水乙醇100 μl的吸光度。公式中引入A2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。
2.3 ·OH清除能力测定
损伤管：30 μl 0.75 mmol/L邻二氮菲无水溶液中加入60 μl 0.15 M的PBS（pH=7.4），加入30 μl的蒸馏水，充分混匀后，加入30 μl 0.75 mmol/L的硫酸亚铁，混匀后，再加入30 μl的1%的H2O2混匀。37℃的水浴中60 min后，在536 nm处，测定吸光度为A损；未损伤管：以30 μl的蒸馏水代替H2O2重复上述操作，在536 nm处，测定吸光度为A未损；样品管：以30 μl的样品代替30 μl的蒸馏水重复损伤管组操作，在536 nm处，测定吸光度为A样；样品参比：60 μl 0.15mol/L的PBS中加30 μl的样品，充分混匀后，加入90 μl的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为A参；空白参比：60 μl 0.15 mol/L的PBS加入120 μl的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为A空。
·OH清除率（%）=［（A样-A参-A损+A空）/（A未损- A损）］×100%
2.4 超氧阴离子生成抑制能力测定
取浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl（pH=8.2）缓冲液100 μl，25 ℃预热20 min后，加入 50 μl不同浓度的薰衣草精油，立即加入40 μl的3 mmol/L的邻苯三酚，振荡使之充分反应，4 min后，用10 μl的3 mol/L的HCl终止反应，在325 nm处测定吸光度（A1），平行测定3次。模型对照组（A0）用50 μl的蒸馏水代替样品液。空白对照组（A2）用40 μl的蒸馏水代替邻苯三酚。
O-2· 抑制率（%）=［（A0-A1+ A2）/A0］×100%
2.5 卵黄脂质过氧化抑制能力测定
卵黄悬液的配制：卵黄用等体积的pH=7.4的0.1 M PBS配成1∶1悬液，并用磁力搅拌器搅拌10 min（置于冰箱中4℃）备用，使用前用PBS稀释成1∶25的悬液。吸取1∶25的卵黄悬液20 μl,加入20 μl的不用浓度的薰衣草精油，再加入20 μl的25 mmol/L的FeSO4，用pH=7.4，0.1 mol/L的PBS补至200 μl,37℃振荡15 min，取出后再加入50 μl的20%的三氯乙酸，4 000 r/min离心8 min，吸取100 μl上清液加入50 μl 0.8% TBA，封口，沸水浴中煮15 min，在532 nm处测吸光度，平行测定3次。以不加样品管的吸光度为A0。以样品加PBS管的吸光度为A样。
抑制率（%）=［（A0-A+A样）/A0］×100%
2.6 红细胞溶血实验
取新鲜大鼠血液，加入备有肝素钠的离心管中，制成抗凝血，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，用PBS（pH=7.4） 洗涤，3 000 r/min离心10 min，重复2次，得到压积红细胞，以PBS（pH=7.4）将压积红细胞配成2.5%混悬液。各取100 μl2.5%红细胞悬液，加入不同浓度样品溶液50 μl，加入100 μl的0.5 mmol/L氢过氧化枯烯，37 ℃温孵3.5 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液测定OD710（A）；取100 μl的红细胞加50 μl的PBS,100 μl的蒸馏水，作为完全溶血的对照，同样处理，测定 OD710 （B）。按公式 （A/B） ×100 %计算溶血的变化。
3 结果
3.1 薰衣草精油的外观状态与得率水蒸气蒸馏法制备的薰衣草精油为微黄色澄清油状液体，香气柔和，得率在0.7%～0.9%。超临界CO2萃取法制备的薰衣草精油为深黄色微浑浊油状液体，香气较浓烈，近似真花香，得率在3.1%～4.2%。·OH清除能力测定Fenton反应产生的羟自由基使邻二氮菲吸光度降低，清除剂清除·OH，吸光度升高，利用反应前后吸光度值A的变化来测定清除率。从图2可得知，两种方法提取的薰衣草精油具有一定的清除·OH的能力，且呈剂量依赖关系。t检验表明，超临界CO2萃取法提取的薰衣草精油清除·OH能力较强，与水蒸气蒸馏法提取的精油之间的抗氧化能力差异显着（P＜0.01）。
超氧阴离子清除能力测定在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成O -2·和有色中间产物，该有色物质在325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时，O -2·的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在325 nm处的吸光度减小。故通过测定A325值可以定量计算出清除剂的清除率。实验结果（见图3）表明，两种方法提取的薰衣草精油对超氧阴离子的生成均有抑制作用，且作用随着剂量的增加而增强。超临界CO2萃取法提取的薰衣草精油作用较强，EC50为60.5 mg/L；水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油作用较弱，EC50为72.5 mg/L，差异具有统计学意义（P＜0.01）。薰衣草精油具有良好的开发和应用价值，超临界CO2萃取薰衣草精油技术值得开展产业化研究。但薰衣草精油有效成分与抗氧化活性之间的关系，以及在抗氧化体系中的分子机制等还有待进一步的研究。
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