分析体外培养物类型对刺五加苷B、E产量的影响-关于内科护理论文
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1 材料与方法
1.1 愈伤组织和体细胞胚胎的获得刺五加野生植株和种子采自吉林省伊通满族自治县西苇镇。种子经层积处理后，将种子的胚剖出，切取胚轴和野生植株萌发15 d以内的幼叶、叶柄作为外植体，接种在包含2,4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0或2.0 mg/L MS培养基上，分别诱导产生愈伤组织或体细胞胚胎。
1.2 愈伤组织和体细胞胚胎质量的测定
将上述产自同一外植体的愈伤组织和体细胞胚胎分别继代入添加了0～1.0 mg/L 2,4-D的MS和1/2MS培养基中诱导愈伤组织增殖、体细胞胚胎产生次级体胚。培养60，120，180，240 d时分别取出增殖产生的全部愈伤组织和体细胞胚胎。用重蒸水洗净粘附的培养基后，置于滤纸上吸干表面水珠，称取质量。
1.3 刺五加苷B、E含量的测定
HP-1100高效液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂为分析纯。对照品购自中国药品生物制品检定所，刺五加苷B编号为111574-200201，刺五加苷E编号为111713-200501。色谱条件：色谱柱：Kromasil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：0.1％ 磷酸水溶液-乙腈（0→25 min，90∶10→80∶20），流速为0.8 ml·min-1；柱温：室温。刺五加苷 B、苷 E 的检测波长分别是220 nm及206 nm。
取刺五加的体外培养物置于干燥箱中70℃烘干后，粉碎。精密称取0.5 g，置于100 ml圆底烧瓶中。参照文献［7］的方法，加入50％甲醇溶液20 ml，回流提取1 h，抽滤，滤液用50％ 甲醇溶解定容至25 ml。取滤液适量，12 000 r·min-1离心5 min，上清液作为供试品溶液。测定其刺五加苷B、E的峰面积，根据刺五加苷 B 的回归方程Y= 64.584X+2.8729,刺五加苷E回归方程Y=89.603X+23.808，计算刺五加苷B、E含量。
1.4 刺五加苷B、E产量的计算公式为：刺五加苷B、E产量（mg）=刺五加苷B、E含量（mg/100g）×培养物质量（g）/100。
2 结果
2.1 体外培养物类型对刺五加苷B、E产量的影响以相同质量的外植体材料为起始材料，分别按照最佳体细胞胚胎和愈伤组织培养体系经240 d培养后诱导产生的愈伤组织和体细胞胚胎的刺五加苷B、E产量如表1所示。
在整个培养过程中，愈伤组织和体细胞胚胎的物质质量随着培养时间的延长呈现指数增长。在测定的4个时间点上，诱导产生的愈伤组织的质量均大于体细胞胚胎的质量。刺五加苷B、E的含量在愈伤组织培养120 d以内逐渐上升，培养时间超过120 d后含量维持在稳定状态；体细胞胚胎自产生开始到培养240 d范围内的刺五加苷B、E含量均差异不大。综合考虑刺五加苷B、E含量和物质质量两个因素的变化，体细胞胚胎虽然在总物质质量上均低于愈伤组织，但由于刺五加苷B、E含量较高，因此在相同培养时间内，同质量外植体产生的体细胞胚胎的刺五加苷B、E的产量优于愈伤组织。
2.2 激素对刺五加苷B、E产量的影响2,4-D对体细胞胚胎生产刺五加苷的影响如表2所示。刺五加苷B、E产量较高的体细胞胚胎在2,4-D 0～1.0 mg/L范围内培养60 d内，刺五加苷B、E含量差异不显着，因此刺五加苷B、E的产量主要受激素对体细胞胚胎质量的影响。2,4-D浓度为0或0.1 mg/L时体外先期产生的体细胞胚胎逐渐产生大量次级体细胞胚胎，而0.5，1.0 mg/L的情况下次级体胚产生量极少，同时早期产生的体胚出现畸形现象。在1.0 mg/L的2,4-D的处理中，原有体细胞胚胎与培养基接触处逐渐产生愈伤组织，该愈伤组织整体继代入不含2,4-D的MS培养基后可产生新的体细胞胚胎，但其产生量较少。
MS培养基处理中体细胞胚胎的刺五加苷B含量显着高于1/2MS培养基处理的含量，刺五加苷E含量在两者之间差异不大。MS培养基中培养物质量略高于1/2MS培养基。在相同条件下培养60 d后MS培养基的刺五加苷B、E产量略优于1/2MS培养基的处理。
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1 材料与方法
1.1 愈伤组织和体细胞胚胎的获得刺五加野生植株和种子采自吉林省伊通满族自治县西苇镇。种子经层积处理后，将种子的胚剖出，切取胚轴和野生植株萌发15 d以内的幼叶、叶柄作为外植体，接种在包含2,4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0或2.0 mg/L MS培养基上，分别诱导产生愈伤组织或体细胞胚胎。
1.2 愈伤组织和体细胞胚胎质量的测定
将上述产自同一外植体的愈伤组织和体细胞胚胎分别继代入添加了0～1.0 mg/L 2,4-D的MS和1/2MS培养基中诱导愈伤组织增殖、体细胞胚胎产生次级体胚。培养60，120，180，240 d时分别取出增殖产生的全部愈伤组织和体细胞胚胎。用重蒸水洗净粘附的培养基后，置于滤纸上吸干表面水珠，称取质量。
1.3 刺五加苷B、E含量的测定
HP-1100高效液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂为分析纯。对照品购自中国药品生物制品检定所，刺五加苷B编号为111574-200201，刺五加苷E编号为111713-200501。色谱条件：色谱柱：Kromasil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：0.1％ 磷酸水溶液-乙腈（0→25 min，90∶10→80∶20），流速为0.8 ml·min-1；柱温：室温。刺五加苷 B、苷 E 的检测波长分别是220 nm及206 nm。
取刺五加的体外培养物置于干燥箱中70℃烘干后，粉碎。精密称取0.5 g，置于100 ml圆底烧瓶中。参照文献［7］的方法，加入50％甲醇溶液20 ml，回流提取1 h，抽滤，滤液用50％ 甲醇溶解定容至25 ml。取滤液适量，12 000 r·min-1离心5 min，上清液作为供试品溶液。测定其刺五加苷B、E的峰面积，根据刺五加苷 B 的回归方程Y= 64.584X+2.8729,刺五加苷E回归方程Y=89.603X+23.808，计算刺五加苷B、E含量。
1.4 刺五加苷B、E产量的计算公式为：刺五加苷B、E产量（mg）=刺五加苷B、E含量（mg/100g）×培养物质量（g）/100。
2 结果
2.1 体外培养物类型对刺五加苷B、E产量的影响以相同质量的外植体材料为起始材料，分别按照最佳体细胞胚胎和愈伤组织培养体系经240 d培养后诱导产生的愈伤组织和体细胞胚胎的刺五加苷B、E产量如表1所示。
在整个培养过程中，愈伤组织和体细胞胚胎的物质质量随着培养时间的延长呈现指数增长。在测定的4个时间点上，诱导产生的愈伤组织的质量均大于体细胞胚胎的质量。刺五加苷B、E的含量在愈伤组织培养120 d以内逐渐上升，培养时间超过120 d后含量维持在稳定状态；体细胞胚胎自产生开始到培养240 d范围内的刺五加苷B、E含量均差异不大。综合考虑刺五加苷B、E含量和物质质量两个因素的变化，体细胞胚胎虽然在总物质质量上均低于愈伤组织，但由于刺五加苷B、E含量较高，因此在相同培养时间内，同质量外植体产生的体细胞胚胎的刺五加苷B、E的产量优于愈伤组织。
2.2 激素对刺五加苷B、E产量的影响2,4-D对体细胞胚胎生产刺五加苷的影响如表2所示。刺五加苷B、E产量较高的体细胞胚胎在2,4-D 0～1.0 mg/L范围内培养60 d内，刺五加苷B、E含量差异不显着，因此刺五加苷B、E的产量主要受激素对体细胞胚胎质量的影响。2,4-D浓度为0或0.1 mg/L时体外先期产生的体细胞胚胎逐渐产生大量次级体细胞胚胎，而0.5，1.0 mg/L的情况下次级体胚产生量极少，同时早期产生的体胚出现畸形现象。在1.0 mg/L的2,4-D的处理中，原有体细胞胚胎与培养基接触处逐渐产生愈伤组织，该愈伤组织整体继代入不含2,4-D的MS培养基后可产生新的体细胞胚胎，但其产生量较少。
MS培养基处理中体细胞胚胎的刺五加苷B含量显着高于1/2MS培养基处理的含量，刺五加苷E含量在两者之间差异不大。MS培养基中培养物质量略高于1/2MS培养基。在相同条件下培养60 d后MS培养基的刺五加苷B、E产量略优于1/2MS培养基的处理。
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