探讨天山花楸叶总黄酮提取工艺效率-内分泌内科护理论文
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1 材料
美国Agilent HP1100型高效液相色谱系统（配有：四元泵，紫外检测器，HP1100化学工作站）；日本岛津UV 2401（PC）紫外光谱仪；德国Sartorius BP211D十万分之一电子分析天平；SK5200HP超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，磷酸、乙醇及其它试剂均为分析纯；芦丁对照品由中国药品生物制品鉴定所提供；天山花楸供试品采自新疆玛纳斯林场，海拔2 000～2 500 m，由石河子大学药学院成玉怀高级实验师鉴定为蔷薇科（Rosaceae）花楸属植物（Sorbus）。
2 方法与结果
2.1 亚硝酸钠-硝酸铝比色法测样品中总黄酮含量芦丁标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品20 mg于50 ml量瓶中，超声溶解，用60％乙醇定容至刻度，摇匀备用。分别精密移取上述对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 ml 于25 ml量瓶中加60％乙醇至6.0 ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml放置6 min，加入8%硝酸铝溶液1.0 ml放置6 min，加入5％氢氧化钠试液10 ml定容，放置15 min后以试剂空白为参比溶液于510 nm测吸光度。
2.2 HPLC分析
2.2.1 色谱条件 Waters C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长 360 nm；温度 25 ℃；运行时间 30 min；平衡时间 10 min；进样量 20 μl，梯度洗脱条件见表1。
2.2.2 HPLC图谱在上述HPLC色谱条件下，样品中各组分的色谱峰分离度良好。结果见图1。
2.2.3 HPLC分析指标建立 本课题组药理实验证明，醋酸乙酯提取物为药理实验有效部位。经理化鉴定及TLC分析结果显示该有效部位呈黄酮类化合物阳性反应。通过对比图1中各样品HPLC图谱，在20～30 min其共有峰保留时间和整体图貌具有良好的一致性。色谱分析中，化合物保留时间，取决于化合物特定的色谱行为，可以确定20～30 min一系列色谱峰为黄酮类化合物色谱峰。因此，本实验选择积分HPLC图谱20～30 min各组分色谱峰，计算相对积分峰面积（各组分积分峰面之和与样品质量的比值，记作：A/μg），对指标进行量化，并以此分析样品。
2.3 正交实验设计结合预实验实际情况，选提取温度（A）、料液比（B）和乙醇浓度（C）为影响总黄酮提出的主要因素，每个因素取3个水平（见表2），选用L9（34）正交实验表安排实验，其中超声功率60 kHz，时间30 min，连续提取两次。精确称取天山花楸叶干粉2.0 g，加入不同溶剂系统，平行提取条件下操作，按“2.1”项测定并计算总黄酮含量及相对积分峰面积。
2.4 正交实验结果及分析
由表3～4结果分析表明，以总黄酮含量为指标时，因素A对总黄酮提取实验影响显着，影响顺序为A>B>C，最佳提取工艺条件为A2B3C3；由表3，表5分析表明，以HPLC图谱相对积分峰面积为指标时，因素A、C对总黄酮提取实验影响显着，影响顺序为A>C>B，最佳提取工艺条件为A3B1C2。最佳工艺条件验证实验 通过以上实验，综合分析考虑，最终选用相对积分峰面积为指标，最佳提取工艺条件确定为A3B2C2，即提取温度为60℃ ，料液比为1/10 g/ml，乙醇浓度为60％，其中超声功率60 Hz，时间30 min，连续提取两次。在此最佳工艺条件下平行进行3次实验，总黄酮提取率较高且稳定。
与比色法测定总黄酮含量为指标相比，以HPLC图谱中黄酮类化合物相对积分峰面积为指标对样品的分析方法具有专属性强、准确度高、重复性好等特点，易于生药及制剂质量控制。以其确定的天山花楸叶总黄酮提取工艺合理，提取率稳定。
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美国Agilent HP1100型高效液相色谱系统（配有：四元泵，紫外检测器，HP1100化学工作站）；日本岛津UV 2401（PC）紫外光谱仪；德国Sartorius BP211D十万分之一电子分析天平；SK5200HP超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，磷酸、乙醇及其它试剂均为分析纯；芦丁对照品由中国药品生物制品鉴定所提供；天山花楸供试品采自新疆玛纳斯林场，海拔2 000～2 500 m，由石河子大学药学院成玉怀高级实验师鉴定为蔷薇科（Rosaceae）花楸属植物（Sorbus）。
2 方法与结果
2.1 亚硝酸钠-硝酸铝比色法测样品中总黄酮含量芦丁标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品20 mg于50 ml量瓶中，超声溶解，用60％乙醇定容至刻度，摇匀备用。分别精密移取上述对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 ml 于25 ml量瓶中加60％乙醇至6.0 ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0 ml放置6 min，加入8%硝酸铝溶液1.0 ml放置6 min，加入5％氢氧化钠试液10 ml定容，放置15 min后以试剂空白为参比溶液于510 nm测吸光度。
2.2 HPLC分析
2.2.1 色谱条件 Waters C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长 360 nm；温度 25 ℃；运行时间 30 min；平衡时间 10 min；进样量 20 μl，梯度洗脱条件见表1。
2.2.2 HPLC图谱在上述HPLC色谱条件下，样品中各组分的色谱峰分离度良好。结果见图1。
2.2.3 HPLC分析指标建立 本课题组药理实验证明，醋酸乙酯提取物为药理实验有效部位。经理化鉴定及TLC分析结果显示该有效部位呈黄酮类化合物阳性反应。通过对比图1中各样品HPLC图谱，在20～30 min其共有峰保留时间和整体图貌具有良好的一致性。色谱分析中，化合物保留时间，取决于化合物特定的色谱行为，可以确定20～30 min一系列色谱峰为黄酮类化合物色谱峰。因此，本实验选择积分HPLC图谱20～30 min各组分色谱峰，计算相对积分峰面积（各组分积分峰面之和与样品质量的比值，记作：A/μg），对指标进行量化，并以此分析样品。
2.3 正交实验设计结合预实验实际情况，选提取温度（A）、料液比（B）和乙醇浓度（C）为影响总黄酮提出的主要因素，每个因素取3个水平（见表2），选用L9（34）正交实验表安排实验，其中超声功率60 kHz，时间30 min，连续提取两次。精确称取天山花楸叶干粉2.0 g，加入不同溶剂系统，平行提取条件下操作，按“2.1”项测定并计算总黄酮含量及相对积分峰面积。
2.4 正交实验结果及分析
由表3～4结果分析表明，以总黄酮含量为指标时，因素A对总黄酮提取实验影响显着，影响顺序为A>B>C，最佳提取工艺条件为A2B3C3；由表3，表5分析表明，以HPLC图谱相对积分峰面积为指标时，因素A、C对总黄酮提取实验影响显着，影响顺序为A>C>B，最佳提取工艺条件为A3B1C2。最佳工艺条件验证实验 通过以上实验，综合分析考虑，最终选用相对积分峰面积为指标，最佳提取工艺条件确定为A3B2C2，即提取温度为60℃ ，料液比为1/10 g/ml，乙醇浓度为60％，其中超声功率60 Hz，时间30 min，连续提取两次。在此最佳工艺条件下平行进行3次实验，总黄酮提取率较高且稳定。
与比色法测定总黄酮含量为指标相比，以HPLC图谱中黄酮类化合物相对积分峰面积为指标对样品的分析方法具有专属性强、准确度高、重复性好等特点，易于生药及制剂质量控制。以其确定的天山花楸叶总黄酮提取工艺合理，提取率稳定。
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