中药熏蒸疗法对关节炎的治疗效果实验研究-护士毕业论文
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1 材料与仪器
1.1 动物健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量（80±20）g，广州军区广州总医院实验动物中心提供。
1.2 药物熏蒸1号方（含羌活20 g，独活20 g，防风15 g，桂枝15 g，细辛10 g，川芎20 g，海风藤30 g，徐长卿30 g，姜黄20 g，苏木20 g，冰片1 g），由广州军区广州总医院中药房提供。熏蒸方中前10味中药由自动煎药机煎煮成53.3%浓度的中药液保存，熏蒸治疗时按高低浓度分别稀释成6.67%和3.33%浓度的中药液，冰片待熏蒸治疗前加入中药液中。中药熏蒸治疗设备自制动物熏蒸装置；电子恒温三用水箱，广东省汕头市医用设备厂产品，型号HH·W21·Cr42II；T型管足肿测量仪（自制）。
1.3 试剂小牛源II型胶原，广州威佳生物科技有限公司提供，Chondrex公司产品；弗氏不完全佐剂，广州威佳生物科技有限公司提供，Calbiochem公司产品；大鼠IL-1β、IL-1ra的ELISA检测试剂盒，武汉中美科技有限公司提供，Sigma公司产品；大鼠IL-1β的RT-PCR检测试剂盒，武汉中美科技有限公司提供，；EB（溴化乙锭），美国Sigma公司；DNA分子量标准，宝生物工程（大连）有限公司。
1.4 仪器PCR扩增仪，Biometra公司；水平电泳仪，Bio-Rad公司；3K30型台式高速冷冻离心机，Sigma公司；FM70制冰机，Grant公司；微量有机分析专用超纯水机，颐洋企业发展有限公司；超低温冰箱，Forma Scientific公司；LD2X-40cI型立式自动电热压力蒸气灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；紫外分光光度计，Biometra；凝胶成像系统，Syngene；DHG-91401型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；低温离心机，美国Beckman公司产品；LEICA－RM2245型组织切片机；Lt2－12550酶标仪，澳大利亚Biocell公司产品；NIKON－E600显微镜，彩色摄象机；电子天平JA2003，上海天平仪器厂；酶标仪，Biocecc htz，编号54809；生化培养箱，广东省正一科技有限公司，型号PYX-250S-B。按照文献合成引物，由上海生工生物技术有限公司合成IL-1β引物：正义链：5'-CTCGCTTGAGAGGTGCTGATGGTAC-3‘，反义链： 5'-GAAGCTGTGGCAGCTACCTATGTCT-3’，扩增产物长度：519 bp;β-actin: 正义链： 5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3‘，反义链： 5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3’，扩增产物长度：226 bp。
2 方法
2.1 CIA大鼠模型复制和分组治疗将40只大鼠随机留取8只作为正常组，其余32只待造模，适应性喂养3 d。取10 mg小牛源II型胶原溶于配制好的0.1 mol/L乙酸5 ml，然后放置4℃冰箱内过夜，次日按2 mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1混合，用注射器反复抽吸，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散为度（在冰浴中操作）；取乳化后大鼠CIA造模剂，于大鼠尾根部及左足底皮内按0.5 ml/只注射，并轻微压迫注射部位30 s，以使乳化物吸收完全。注射后第1天，部分造模组大鼠注射区局部皮肤发红、轻度肿胀、皮温升高，活动欠灵活；第2日部分造模大鼠左后足肿胀继续加重，并于3～7 d开始逐渐消退；至第8日按以上同样的方法再次注射0.3 ml/只，注意需避开上次注射部位；第14日大部分造模大鼠左后足和部分右后足关节出现肿胀、皮肤发亮、充血及关节活动受限；第21日大部分双后足关节及部分前足关节肿胀达到高峰，部分大鼠出现皮肤溃疡。多发性关节炎的出现表明大鼠CIA模型建立成功。造模后第21天，32只模型大鼠随机分成4组，模型组、水熏组、低熏组、高熏组各8只。正常组和模型组常规喂养，不做熏蒸处理；水熏组给予（57±1）℃蒸馏水熏蒸，蒸气温度为（39±1）℃；低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸；高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入自制动物熏蒸装置，开启电子恒温水槽，待蒸气温度达到熏蒸要求时，开始熏蒸并计时，熏蒸20 min/次，连续20 d。
2.2 大鼠滑膜细胞的获取、细胞因子mRNA的诱生和总RNA的抽提造模后第41天，以自配麻醉剂（5%盐酸氯胺酮注射液20 ml，2.5%盐酸异丙嗪注射液20 ml、0.05%硫酸阿托品注射液10 ml混匀），于每只大鼠腹腔注射0.6～0.8 ml，迅速麻醉，麻醉后心腔取血，后以颈椎脱臼法处死，取膝关节滑膜组织，液氮下保存待测，之后进行大鼠滑膜细胞总RNA的提取，其步骤如下：
2.2.1 匀浆取100 mg大鼠滑膜组织置于盛有适量液氮的碾钵中充分碾磨，每100 mg组织加1 ml的Trizol，颠倒EP管数次混匀，室温放置5 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清移入另外一个离心管中，匀浆时组织样品容积不能超过Trizol容积的10%。
2.2.2 分离将匀浆样品在15～30°C条件下孵育5 min以使核蛋白体完全分解，每毫升Trizol加0.2 ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 s并将其在30℃下孵育2～3 min，在2～8℃下以不超过12 000 r/min的离心力高速冷冻离心15 min，离心后混合物分成3层：下层红色的苯酚-氯仿层、中间层、上层无色的水样层，RNA无一例外地存在于水样层。
2.2.3 沉淀将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA，最初均化时的每毫升Trizol对应0.5 ml异丙醇，将混合的样品在15～30℃条件下孵育10 min并在2～8℃下以不超过12 000 r/min的离心力高速冷冻离心10 min，RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
2.2.4 洗脱移去上层悬液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，每毫升的Trizol至少加1 ml的75%乙醇，漩涡振荡混合样品并在2～8℃下以不超过7 500 r/min的离心力高速冷冻离心5 min。
2.2.5 再溶解简单干燥RNA沉淀，尤为重要的是不能让RNA沉淀完全干燥，那样会极大地降低它的可溶性，用移液管尖分几次移取无RNA酶的水来溶解RNA，于-70℃保存。
2.2.6 总RNA的琼脂糖凝胶电泳①电泳RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗两遍后在室温晾干备用。②用新的1×TBE配制1.2%琼脂糖凝胶，倒胶时溴化乙锭（EB）直接加入凝胶中。③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1×TBE，液面只能刚好同胶面平齐，缓冲液不要淹过胶面。④点样时，样品RNA每10 μl加入2 μl上样缓冲液，上样缓冲液是用DEPC处理的水配制的50%甘油，另外单独点一样品孔含有3 μl溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂，电泳电压4 V/CM，电泳时间2 h左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA的质量，同时进行拍照记录。
3 结果
总RNA完整性的鉴定图1结果显示，取CIA模型大鼠膝关节滑膜组织RNA3 μg和6 μg，按前述方法以1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，可见28S、18S、5.8S（5S）3条清晰的rRNA条带，经用RNaseA酶消化的样品条带消失，表明提取物确为RNA。在电泳后能观察到28S、18S、5.8S（5S），特别是28S清晰的带型，通常认为所提取的RNA未被降解，可以用提取的RNA进行后续实验。
表1和图2结果表明，正常组见非常微弱条带，模型组在519 bp处可见有一清晰的电泳带，基因表达最强，与预期的IL-1β mRNA基因片段长度相符。低熏组和水熏组可见有较弱的电泳条带，高熏组在519 bp处条带最弱，基因表达回落说明中药熏蒸疗法能显着抑制CIA大鼠滑膜细胞异常升高的IL-1β mRNA的表达，使其趋于正常（P<0.01）； 低熏组和水熏组对CIA大鼠滑膜细胞IL-1β mRNA的表达也有一定的下调作用（P<0.05）；但模型组却进一步上调了CIA大鼠滑膜细胞IL-1β mRNA表达（P<0.05）。
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1 材料与仪器
1.1 动物健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量（80±20）g，广州军区广州总医院实验动物中心提供。
1.2 药物熏蒸1号方（含羌活20 g，独活20 g，防风15 g，桂枝15 g，细辛10 g，川芎20 g，海风藤30 g，徐长卿30 g，姜黄20 g，苏木20 g，冰片1 g），由广州军区广州总医院中药房提供。熏蒸方中前10味中药由自动煎药机煎煮成53.3%浓度的中药液保存，熏蒸治疗时按高低浓度分别稀释成6.67%和3.33%浓度的中药液，冰片待熏蒸治疗前加入中药液中。中药熏蒸治疗设备自制动物熏蒸装置；电子恒温三用水箱，广东省汕头市医用设备厂产品，型号HH·W21·Cr42II；T型管足肿测量仪（自制）。
1.3 试剂小牛源II型胶原，广州威佳生物科技有限公司提供，Chondrex公司产品；弗氏不完全佐剂，广州威佳生物科技有限公司提供，Calbiochem公司产品；大鼠IL-1β、IL-1ra的ELISA检测试剂盒，武汉中美科技有限公司提供，Sigma公司产品；大鼠IL-1β的RT-PCR检测试剂盒，武汉中美科技有限公司提供，；EB（溴化乙锭），美国Sigma公司；DNA分子量标准，宝生物工程（大连）有限公司。
1.4 仪器PCR扩增仪，Biometra公司；水平电泳仪，Bio-Rad公司；3K30型台式高速冷冻离心机，Sigma公司；FM70制冰机，Grant公司；微量有机分析专用超纯水机，颐洋企业发展有限公司；超低温冰箱，Forma Scientific公司；LD2X-40cI型立式自动电热压力蒸气灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；紫外分光光度计，Biometra；凝胶成像系统，Syngene；DHG-91401型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；低温离心机，美国Beckman公司产品；LEICA－RM2245型组织切片机；Lt2－12550酶标仪，澳大利亚Biocell公司产品；NIKON－E600显微镜，彩色摄象机；电子天平JA2003，上海天平仪器厂；酶标仪，Biocecc htz，编号54809；生化培养箱，广东省正一科技有限公司，型号PYX-250S-B。按照文献合成引物，由上海生工生物技术有限公司合成IL-1β引物：正义链：5'-CTCGCTTGAGAGGTGCTGATGGTAC-3‘，反义链： 5'-GAAGCTGTGGCAGCTACCTATGTCT-3’，扩增产物长度：519 bp;β-actin: 正义链： 5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3‘，反义链： 5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3’，扩增产物长度：226 bp。
2 方法
2.1 CIA大鼠模型复制和分组治疗将40只大鼠随机留取8只作为正常组，其余32只待造模，适应性喂养3 d。取10 mg小牛源II型胶原溶于配制好的0.1 mol/L乙酸5 ml，然后放置4℃冰箱内过夜，次日按2 mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1混合，用注射器反复抽吸，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散为度（在冰浴中操作）；取乳化后大鼠CIA造模剂，于大鼠尾根部及左足底皮内按0.5 ml/只注射，并轻微压迫注射部位30 s，以使乳化物吸收完全。注射后第1天，部分造模组大鼠注射区局部皮肤发红、轻度肿胀、皮温升高，活动欠灵活；第2日部分造模大鼠左后足肿胀继续加重，并于3～7 d开始逐渐消退；至第8日按以上同样的方法再次注射0.3 ml/只，注意需避开上次注射部位；第14日大部分造模大鼠左后足和部分右后足关节出现肿胀、皮肤发亮、充血及关节活动受限；第21日大部分双后足关节及部分前足关节肿胀达到高峰，部分大鼠出现皮肤溃疡。多发性关节炎的出现表明大鼠CIA模型建立成功。造模后第21天，32只模型大鼠随机分成4组，模型组、水熏组、低熏组、高熏组各8只。正常组和模型组常规喂养，不做熏蒸处理；水熏组给予（57±1）℃蒸馏水熏蒸，蒸气温度为（39±1）℃；低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸；高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入自制动物熏蒸装置，开启电子恒温水槽，待蒸气温度达到熏蒸要求时，开始熏蒸并计时，熏蒸20 min/次，连续20 d。
2.2 大鼠滑膜细胞的获取、细胞因子mRNA的诱生和总RNA的抽提造模后第41天，以自配麻醉剂（5%盐酸氯胺酮注射液20 ml，2.5%盐酸异丙嗪注射液20 ml、0.05%硫酸阿托品注射液10 ml混匀），于每只大鼠腹腔注射0.6～0.8 ml，迅速麻醉，麻醉后心腔取血，后以颈椎脱臼法处死，取膝关节滑膜组织，液氮下保存待测，之后进行大鼠滑膜细胞总RNA的提取，其步骤如下：
2.2.1 匀浆取100 mg大鼠滑膜组织置于盛有适量液氮的碾钵中充分碾磨，每100 mg组织加1 ml的Trizol，颠倒EP管数次混匀，室温放置5 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清移入另外一个离心管中，匀浆时组织样品容积不能超过Trizol容积的10%。
2.2.2 分离将匀浆样品在15～30°C条件下孵育5 min以使核蛋白体完全分解，每毫升Trizol加0.2 ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 s并将其在30℃下孵育2～3 min，在2～8℃下以不超过12 000 r/min的离心力高速冷冻离心15 min，离心后混合物分成3层：下层红色的苯酚-氯仿层、中间层、上层无色的水样层，RNA无一例外地存在于水样层。
2.2.3 沉淀将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA，最初均化时的每毫升Trizol对应0.5 ml异丙醇，将混合的样品在15～30℃条件下孵育10 min并在2～8℃下以不超过12 000 r/min的离心力高速冷冻离心10 min，RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
2.2.4 洗脱移去上层悬液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，每毫升的Trizol至少加1 ml的75%乙醇，漩涡振荡混合样品并在2～8℃下以不超过7 500 r/min的离心力高速冷冻离心5 min。
2.2.5 再溶解简单干燥RNA沉淀，尤为重要的是不能让RNA沉淀完全干燥，那样会极大地降低它的可溶性，用移液管尖分几次移取无RNA酶的水来溶解RNA，于-70℃保存。
2.2.6 总RNA的琼脂糖凝胶电泳①电泳RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗两遍后在室温晾干备用。②用新的1×TBE配制1.2%琼脂糖凝胶，倒胶时溴化乙锭（EB）直接加入凝胶中。③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1×TBE，液面只能刚好同胶面平齐，缓冲液不要淹过胶面。④点样时，样品RNA每10 μl加入2 μl上样缓冲液，上样缓冲液是用DEPC处理的水配制的50%甘油，另外单独点一样品孔含有3 μl溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂，电泳电压4 V/CM，电泳时间2 h左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA的质量，同时进行拍照记录。
3 结果
总RNA完整性的鉴定图1结果显示，取CIA模型大鼠膝关节滑膜组织RNA3 μg和6 μg，按前述方法以1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，可见28S、18S、5.8S（5S）3条清晰的rRNA条带，经用RNaseA酶消化的样品条带消失，表明提取物确为RNA。在电泳后能观察到28S、18S、5.8S（5S），特别是28S清晰的带型，通常认为所提取的RNA未被降解，可以用提取的RNA进行后续实验。
表1和图2结果表明，正常组见非常微弱条带，模型组在519 bp处可见有一清晰的电泳带，基因表达最强，与预期的IL-1β mRNA基因片段长度相符。低熏组和水熏组可见有较弱的电泳条带，高熏组在519 bp处条带最弱，基因表达回落说明中药熏蒸疗法能显着抑制CIA大鼠滑膜细胞异常升高的IL-1β mRNA的表达，使其趋于正常（P<0.01）； 低熏组和水熏组对CIA大鼠滑膜细胞IL-1β mRNA的表达也有一定的下调作用（P<0.05）；但模型组却进一步上调了CIA大鼠滑膜细胞IL-1β mRNA表达（P<0.05）。
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