温莪术内生真菌的分离提取方法研究-肱骨干骨折论文
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1 材料
1.1 材 料
分离所用植物材料为温莪术根、茎、叶，采自温州医学院莪术种植基地不同生长时期的温莪术，无病虫害。
1.2 培养基内生真菌分离培养基为PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 ml ）和WA—抗生素培养基（琼脂20 g，氨苄青霉素200 mg，链霉素200 mg，水1 000 ml ）；纯化鉴定培养基为PDA培养基和查氏培养基（蔗糖30 g，NaNO3 2 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml）。
2 方法
2.1 内生真菌的分离取温莪术的根、茎、叶，用刀切成2～3 cm的小块，按下列步骤进行表面消毒：自来水冲洗干净，75%的酒精漂洗1～2 min，无菌水冲洗3 min，0.1%的升汞漂洗10～20 s，无菌水冲洗4～5次。上述处理过的样品，在无菌状态下切割成约0.5 cm×0.5 cm 的小块（片）， 分别置于已倒好的WA—抗生素平板培养基和PDA平板培养基上，放置在28℃条件下。
2.2 内生真菌的纯化接种物培养3～7 d后，观察皿中材料切口处长出菌丝（菌落），挑取切口处菌丝尖端转接到新的PDA平板上，待长成菌落后，根据菌落形态、颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取其边缘的菌丝进行分离培养，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录。采用菌丝顶端纯化法如此反复纯化后，转入PDA斜面培养基上，于28℃培养箱中培养5～7 d后，对菌株进行编号，并放入4℃冰箱保存。
2.3 菌种的鉴定采用直接挑取制片法和插片培养法，观测菌种在培养过程中菌丝、个体发育、产孢结构和孢子形态等特征，对分离得到的内生真菌进行显微形态观察、分类鉴定［8～11］。
3 结果
3.1 分离方法的比较本实验过程中尝试了组织研磨涂平板和组织切片分离两种方法。结果表明研磨法的优点是能获得较多菌株，但表面消毒验证效果不佳，且菌株不易纯化；而组织切片培养的方法操作简单，表面消毒验证效果可靠，菌株易纯化。为此本研究最终选择了表面消毒后组织分离培养的方法。
3.2 温莪术内生真菌的分离及分类鉴定结果从温莪术根、茎、叶组织分离中，共获得内生真菌99株。从表1可看出，植物组织的部位不同，分离获得的内生真菌种类不同。从分布上来看，99株内生真菌中，根部分布42株内生真菌，占总菌株数的42%，11个属，占21个属的52%；茎部分布12株0内生真菌，占总菌株数的12%，4个属，占21个属的19%；叶部分布45株内生真菌，占总菌株数的45%，12个属，占21个属的57%。由此可见，温莪术内生真菌主要存在于植株的根和叶中，茎部相对较少。
3.3 温莪术内生真菌的种群组成 从温莪术不同组织中分离得到的99株内生真菌，经显微形态观察，初步鉴定为5目、6科、21属，另外，还有9株不产孢，为无孢菌群（见表2）。由表2可知，温莪术内生真菌以镰孢霉属为优势种群，约占总数的13%；其次为曲霉属和青霉属，约占总数的10%；此外，无孢菌群在其内生真菌中也占有较大的比例。从表中可见温莪术内生真菌最明显的特征是在种类组成上具有多样性。
植物内生真菌和其宿主之间存在复杂的生物化学相互作用，植物形成的某些次生代谢产物可能就是内生真菌转化宿主组织中的前体物质所形成，本研究为进一步探讨植物与内生真菌的相互关系提供了重要的资料。
骨折康复论文 http://www.qikanba.com/
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1.1 材 料
分离所用植物材料为温莪术根、茎、叶，采自温州医学院莪术种植基地不同生长时期的温莪术，无病虫害。
1.2 培养基内生真菌分离培养基为PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 ml ）和WA—抗生素培养基（琼脂20 g，氨苄青霉素200 mg，链霉素200 mg，水1 000 ml ）；纯化鉴定培养基为PDA培养基和查氏培养基（蔗糖30 g，NaNO3 2 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml）。
2 方法
2.1 内生真菌的分离取温莪术的根、茎、叶，用刀切成2～3 cm的小块，按下列步骤进行表面消毒：自来水冲洗干净，75%的酒精漂洗1～2 min，无菌水冲洗3 min，0.1%的升汞漂洗10～20 s，无菌水冲洗4～5次。上述处理过的样品，在无菌状态下切割成约0.5 cm×0.5 cm 的小块（片）， 分别置于已倒好的WA—抗生素平板培养基和PDA平板培养基上，放置在28℃条件下。
2.2 内生真菌的纯化接种物培养3～7 d后，观察皿中材料切口处长出菌丝（菌落），挑取切口处菌丝尖端转接到新的PDA平板上，待长成菌落后，根据菌落形态、颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取其边缘的菌丝进行分离培养，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录。采用菌丝顶端纯化法如此反复纯化后，转入PDA斜面培养基上，于28℃培养箱中培养5～7 d后，对菌株进行编号，并放入4℃冰箱保存。
2.3 菌种的鉴定采用直接挑取制片法和插片培养法，观测菌种在培养过程中菌丝、个体发育、产孢结构和孢子形态等特征，对分离得到的内生真菌进行显微形态观察、分类鉴定［8～11］。
3 结果
3.1 分离方法的比较本实验过程中尝试了组织研磨涂平板和组织切片分离两种方法。结果表明研磨法的优点是能获得较多菌株，但表面消毒验证效果不佳，且菌株不易纯化；而组织切片培养的方法操作简单，表面消毒验证效果可靠，菌株易纯化。为此本研究最终选择了表面消毒后组织分离培养的方法。
3.2 温莪术内生真菌的分离及分类鉴定结果从温莪术根、茎、叶组织分离中，共获得内生真菌99株。从表1可看出，植物组织的部位不同，分离获得的内生真菌种类不同。从分布上来看，99株内生真菌中，根部分布42株内生真菌，占总菌株数的42%，11个属，占21个属的52%；茎部分布12株0内生真菌，占总菌株数的12%，4个属，占21个属的19%；叶部分布45株内生真菌，占总菌株数的45%，12个属，占21个属的57%。由此可见，温莪术内生真菌主要存在于植株的根和叶中，茎部相对较少。
3.3 温莪术内生真菌的种群组成 从温莪术不同组织中分离得到的99株内生真菌，经显微形态观察，初步鉴定为5目、6科、21属，另外，还有9株不产孢，为无孢菌群（见表2）。由表2可知，温莪术内生真菌以镰孢霉属为优势种群，约占总数的13%；其次为曲霉属和青霉属，约占总数的10%；此外，无孢菌群在其内生真菌中也占有较大的比例。从表中可见温莪术内生真菌最明显的特征是在种类组成上具有多样性。
植物内生真菌和其宿主之间存在复杂的生物化学相互作用，植物形成的某些次生代谢产物可能就是内生真菌转化宿主组织中的前体物质所形成，本研究为进一步探讨植物与内生真菌的相互关系提供了重要的资料。
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