概述基于PCR的DNA分子标记技术-护理管理学论文
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2.1 DNA序列分析技术以DNA序列为核心的分子标记技术。建立在PCR技术基础之上的DNA测序分析技术（DNA sequencing）的开发使DNA分子标记技术取得了又一次的突破性进展。
动植物在进化过程中，其基因会发生碱基的重排、替代等，从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异，即可将不同的种区别开来。近年来，由于DNA测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化规律认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列，可以为PCR引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于PCR的DNA直接测序技术，极大地提高了DNA序列分析的效率，促进了该项技术的应用研究。目前用于中药DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL，mat K rpoC 等；植物核基因组的rRNA、ITS等；动物线粒体基因组Cytb基因等 ，这些被选基因的共同特点是进化速率差异大，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘关系与进化等。
动物类药材多用线粒体细胞色素b基因片段的序列变异鉴别药材。1998年吴平［48］通过分析对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12S rRNA基因片段序列来区分正品和混淆品；还通过扩增约450bp的12S rRNA和约490 bp的Cytb基因片段对海马作了DNA序列分析，可作为其它动物药材干样品鉴定的参考。1999年王义权等［49］扩增了乌梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段，通过比较蛇的Cytb基因246 bp的同源DNA序列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。
2.2 AFLP技术扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）标记技术是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法， AFLP是一种RFLP与RAPD相结合而又不使用分子杂交技术的分子标记手段，被誉为新一代的分子标记技术。它的原理是基于对基因组DNA双酶切经PCR扩增后的限制片段进行选择。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，所以，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可以被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上的DNA指纹的有无来检出多态性。由于AFLP预先不需要知道DNA序列的情况，但获得的指纹信息位点要比RAPD技术更为丰富。相比之下。最后完成AFLP实验的成本比用RAPD方法的成本低，更省时间、更方便，而且准确性更高，数据更可靠，技术难度也不大。
2.3 ISSR标记技术简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）技术又称为锚定简单序列重复技术（anchored simple sequence repeat，ASSR）由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在PCR中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表。ISSR标记技术特点：实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点，耗资少，模板DNA用量也少。
2.4 随机扩增片段长度多态性标记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）RAPD技术是由美国的Williams与Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种DNA分子标记技术。Williams等称之为RAPD，Welsh等称之为Ap-PCR（arbitarily primed PCR），此技术利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。RAPD标记只需微量DNA,且对受试基因组无特定要求（不须知道受试基因DNA的背景材料），检测灵敏、方便、多态性强，可以检测出RFLP标记不能检测的重复顺序，可填补RFLP图谱空缺，适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究，也可用于亲缘关系等的研究。相对于其他几种分子标记， RAPD标记是在中药鉴定领域用得最多的分子遗传标记技术， 并对中药鉴定研究产生了深刻的影响。RAPD技术自问世以来 ，在中药鉴定中主要用于中药混淆品、代用品的鉴定，多来源中药的鉴定，名贵中药的鉴定，动物类中药的鉴定等。
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2.1 DNA序列分析技术以DNA序列为核心的分子标记技术。建立在PCR技术基础之上的DNA测序分析技术（DNA sequencing）的开发使DNA分子标记技术取得了又一次的突破性进展。
动植物在进化过程中，其基因会发生碱基的重排、替代等，从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异，即可将不同的种区别开来。近年来，由于DNA测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化规律认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列，可以为PCR引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于PCR的DNA直接测序技术，极大地提高了DNA序列分析的效率，促进了该项技术的应用研究。目前用于中药DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL，mat K rpoC 等；植物核基因组的rRNA、ITS等；动物线粒体基因组Cytb基因等 ，这些被选基因的共同特点是进化速率差异大，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘关系与进化等。
动物类药材多用线粒体细胞色素b基因片段的序列变异鉴别药材。1998年吴平［48］通过分析对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12S rRNA基因片段序列来区分正品和混淆品；还通过扩增约450bp的12S rRNA和约490 bp的Cytb基因片段对海马作了DNA序列分析，可作为其它动物药材干样品鉴定的参考。1999年王义权等［49］扩增了乌梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段，通过比较蛇的Cytb基因246 bp的同源DNA序列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。
2.2 AFLP技术扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）标记技术是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法， AFLP是一种RFLP与RAPD相结合而又不使用分子杂交技术的分子标记手段，被誉为新一代的分子标记技术。它的原理是基于对基因组DNA双酶切经PCR扩增后的限制片段进行选择。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，所以，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可以被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上的DNA指纹的有无来检出多态性。由于AFLP预先不需要知道DNA序列的情况，但获得的指纹信息位点要比RAPD技术更为丰富。相比之下。最后完成AFLP实验的成本比用RAPD方法的成本低，更省时间、更方便，而且准确性更高，数据更可靠，技术难度也不大。
2.3 ISSR标记技术简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）技术又称为锚定简单序列重复技术（anchored simple sequence repeat，ASSR）由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在PCR中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表。ISSR标记技术特点：实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点，耗资少，模板DNA用量也少。
2.4 随机扩增片段长度多态性标记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）RAPD技术是由美国的Williams与Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种DNA分子标记技术。Williams等称之为RAPD，Welsh等称之为Ap-PCR（arbitarily primed PCR），此技术利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。RAPD标记只需微量DNA,且对受试基因组无特定要求（不须知道受试基因DNA的背景材料），检测灵敏、方便、多态性强，可以检测出RFLP标记不能检测的重复顺序，可填补RFLP图谱空缺，适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究，也可用于亲缘关系等的研究。相对于其他几种分子标记， RAPD标记是在中药鉴定领域用得最多的分子遗传标记技术， 并对中药鉴定研究产生了深刻的影响。RAPD技术自问世以来 ，在中药鉴定中主要用于中药混淆品、代用品的鉴定，多来源中药的鉴定，名贵中药的鉴定，动物类中药的鉴定等。
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