运用基因芯片技术观察马齿苋对糖尿病胰岛基因表达影响-中医艾灸护理论文
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1 材料与仪器
1.1 原料
新鲜马齿苋Portulaca oleracea L.于2005-09购于江西南昌市农贸市场，经本校药学院药理学教研室鉴定。用清水洗净，沥干水分，80℃鼓风干燥6 h，粉碎备用。准确称取马齿苋粉末50g，按照1∶30（W∶V）加入蒸馏水，水煎煮3次（1.5，1.0，0.5 h），过滤，合并3次提取液，浓缩提取液，冷却后4 000 r/min离心15 min，取上清液，以无水乙醇调制终浓度为75％，4℃静置过夜，沉淀物再分别以无水乙醇、丙酮、乙醚回流洗涤，得灰白色粗多糖粉末，以适量蒸馏水溶解粉末，置4℃冰箱备用。临用时用蒸馏水配制成0.2和2 mmol/L粗多糖溶液。
1.2 动物
4周龄昆明糖尿病小鼠20只（20～22 g，雄性，购自江西省医学实验动物中心），经随机编号进入①PPS处理组（10只），口服PPS 2 mmol/L 2ml·d-1 30 d；②对照组（10只），口服等量生理盐水30 d。每周测定血糖（尾静脉采用血法），观察8周处死小鼠；新鲜胰腺放-80℃冰箱备用。
1.3 试剂和仪器
各种纯化总RNA的试剂、dNTP由Promega 公司提供，逆转录酶及缓冲液由Gibco BRL公司提供，Taq酶由上海生物工程公司提供；Cy3-dUTP、Cy5-dUTP 由Amersham Phamacia 公司提供，Oligotex total-RNA Midi Kit 购自Ouagen公司。HeraeusT12高温烘箱，SORVALL Evolution RC型离心机，旋转蒸发仪（RE-52AA），Philips Comfort粉碎机，生物芯片研制系统。
2 方法
2.1 mRNA提取
2.1.1 用一步法分别抽提20只小鼠总RNA具体步骤：①取 100 mg 新鲜胰腺组织置1.5 ml离心管中，加入 1 ml Trizol 充分匀浆，室温静置5 min ；②加入 0.2 ml 氯仿，振荡 15 s，静置 2 min；③4 ℃ 离心， 12 000 g 离心 15 min，取上清液；④加入 0.5 ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min ；⑤4 ℃ 离心， 12 000 g 离心 10 min，弃上清液；⑥加入 1 ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 ℃， 7 500 g 离心 5 min ，弃上清液；⑦晾干，加入适量的 DEPC H2O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10～15 min） 。
2.1.2 从总RNA中分离mRNA①取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 μl；②加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀；③70℃水浴，3 min（裂解RNA的二级结构）；④20～30℃条件下，静置10 min（让Oligotex与mRNA结合）；⑤高速离心2 min，小心吸走上清液（该上清液要保留），留下约50 μl的上清液在原管里；⑥用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1 min；⑦将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液；⑧将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20～100 μl热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3～4次，高速离心1 min；⑨为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步；⑩电泳。
2.2 杂交和洗片将基因芯片（上海博星基因芯片有限公司）和杂交探针分别在95℃水浴中变性5 min，将探针加在基因芯片上，用盖玻片封片，置于60℃杂交15～20 h，然后揭开盖玻片，分别用2SSC+0.2%SDS、0.1%SSC+0.2%SDS、0.1%SSC洗涤10 min，室温晾干。
2.3 检测与分析用基因公司的扫描仪 DNASCOP TMLM（激光共聚焦）扫描芯片，用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用40个管家基因进行Cy3和Cy5的均衡。用以下两个条件作为判定基因差异表达的标准：①Cy5/Cy3（比值）＞2或＜0.5；②Cy3或Cy5荧光信号强度＞800。
3 结果
通过紫外分析和琼脂糖凝胶电泳鉴定，OD260/OD280 在1.8以上，电泳呈现28 s，18 s，5 s清晰条带，其中28 s与18 s比值为2，显示获得高质量总RNA且RNA未被降解。采用Oligotex total-RNA Midi Kit分离纯化为mRNA。芯片差异表达健康小鼠和糖尿病小鼠胰腺组织中差异表达的部分基因比值转移生长因子TGF-β为2.451，表现上调，一氧化氮合酶基因（NOS）比值为0.203，表现为下调。
外科护理论文 http://www.qikanba.com/
1 材料与仪器
1.1 原料
新鲜马齿苋Portulaca oleracea L.于2005-09购于江西南昌市农贸市场，经本校药学院药理学教研室鉴定。用清水洗净，沥干水分，80℃鼓风干燥6 h，粉碎备用。准确称取马齿苋粉末50g，按照1∶30（W∶V）加入蒸馏水，水煎煮3次（1.5，1.0，0.5 h），过滤，合并3次提取液，浓缩提取液，冷却后4 000 r/min离心15 min，取上清液，以无水乙醇调制终浓度为75％，4℃静置过夜，沉淀物再分别以无水乙醇、丙酮、乙醚回流洗涤，得灰白色粗多糖粉末，以适量蒸馏水溶解粉末，置4℃冰箱备用。临用时用蒸馏水配制成0.2和2 mmol/L粗多糖溶液。
1.2 动物
4周龄昆明糖尿病小鼠20只（20～22 g，雄性，购自江西省医学实验动物中心），经随机编号进入①PPS处理组（10只），口服PPS 2 mmol/L 2ml·d-1 30 d；②对照组（10只），口服等量生理盐水30 d。每周测定血糖（尾静脉采用血法），观察8周处死小鼠；新鲜胰腺放-80℃冰箱备用。
1.3 试剂和仪器
各种纯化总RNA的试剂、dNTP由Promega 公司提供，逆转录酶及缓冲液由Gibco BRL公司提供，Taq酶由上海生物工程公司提供；Cy3-dUTP、Cy5-dUTP 由Amersham Phamacia 公司提供，Oligotex total-RNA Midi Kit 购自Ouagen公司。HeraeusT12高温烘箱，SORVALL Evolution RC型离心机，旋转蒸发仪（RE-52AA），Philips Comfort粉碎机，生物芯片研制系统。
2 方法
2.1 mRNA提取
2.1.1 用一步法分别抽提20只小鼠总RNA具体步骤：①取 100 mg 新鲜胰腺组织置1.5 ml离心管中，加入 1 ml Trizol 充分匀浆，室温静置5 min ；②加入 0.2 ml 氯仿，振荡 15 s，静置 2 min；③4 ℃ 离心， 12 000 g 离心 15 min，取上清液；④加入 0.5 ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min ；⑤4 ℃ 离心， 12 000 g 离心 10 min，弃上清液；⑥加入 1 ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 ℃， 7 500 g 离心 5 min ，弃上清液；⑦晾干，加入适量的 DEPC H2O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10～15 min） 。
2.1.2 从总RNA中分离mRNA①取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 μl；②加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀；③70℃水浴，3 min（裂解RNA的二级结构）；④20～30℃条件下，静置10 min（让Oligotex与mRNA结合）；⑤高速离心2 min，小心吸走上清液（该上清液要保留），留下约50 μl的上清液在原管里；⑥用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1 min；⑦将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液；⑧将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20～100 μl热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3～4次，高速离心1 min；⑨为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步；⑩电泳。
2.2 杂交和洗片将基因芯片（上海博星基因芯片有限公司）和杂交探针分别在95℃水浴中变性5 min，将探针加在基因芯片上，用盖玻片封片，置于60℃杂交15～20 h，然后揭开盖玻片，分别用2SSC+0.2%SDS、0.1%SSC+0.2%SDS、0.1%SSC洗涤10 min，室温晾干。
2.3 检测与分析用基因公司的扫描仪 DNASCOP TMLM（激光共聚焦）扫描芯片，用ImaGene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用40个管家基因进行Cy3和Cy5的均衡。用以下两个条件作为判定基因差异表达的标准：①Cy5/Cy3（比值）＞2或＜0.5；②Cy3或Cy5荧光信号强度＞800。
3 结果
通过紫外分析和琼脂糖凝胶电泳鉴定，OD260/OD280 在1.8以上，电泳呈现28 s，18 s，5 s清晰条带，其中28 s与18 s比值为2，显示获得高质量总RNA且RNA未被降解。采用Oligotex total-RNA Midi Kit分离纯化为mRNA。芯片差异表达健康小鼠和糖尿病小鼠胰腺组织中差异表达的部分基因比值转移生长因子TGF-β为2.451，表现上调，一氧化氮合酶基因（NOS）比值为0.203，表现为下调。
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