益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞GMC增殖影响研究-中国护理论文
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1 材料与仪器
1.1 益肾蠲湿合剂水煎液由华北煤炭医学院中西医结合医院提供。
1.2 细胞大鼠肾小球系膜细胞（HBZY 1）由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。
1.3 仪器及试剂超净工作台（美国 Forma scientific company）；倒置显微镜（日本Nikon公司）；CO2 恒温培养箱（美国 Forma scientific company）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司产品）；抗体（p-ERK1/2和t-ERK1/2）（美国 Cell Signaling）。
2 方法
2.1 含药血清的制备［4］将大鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂组。对照组给予等体积的生理盐水，益肾蠲湿合剂以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂量和低剂量。灌胃给药连续7 d，第7天重复给药两次，间隔时间2 h，并于末次给药后1 h后，眼球取血，无菌条件下分离血清，置56℃水浴30 min灭活抗体，再经0.2 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。
2.2 细胞增殖的测定检测采用四唑盐（MTT）比色法。GMC传代后，制成密度为1.5×104/ml的细胞悬液，加入96孔板内。每孔200 μl，置37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，吸弃上清液，加入无血清培养液200 μl。继续培养48 h，使绝大部分细胞处于同步（G0期）。弃上清液，分别加入DMEM 培养液（160 μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设5个复孔，分别于培养24，48和72 h时取出培养板加入MTT 20 ul（5 mg/m1），继续培养4 h，吸弃各孔培养液，加入100 μl DMSO，室温避光，轻轻振荡10 min，使结晶充分溶解后，酶标仪490 nm波长处读取OD值。
2.3 磷酸化ERK1/2（p-ERK1／2）表达的检测GMC经上诉方法同步化后，分别加入DMEM 培养液（160μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设2个复孔，培养2 h。用预冷的PBS洗涤3次，加入细胞裂解液（50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaC1，1% NP-40，0.1％ SDS，0.5% DOC，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 μmol/L leupeptin，1 μmol/L pepstatin A，1 mg/ml Laprotinin）裂解细胞，冰浴30 min后， 4℃ 10 000 r/min 离心10 min，收集上清。考马斯亮蓝染色检测总蛋白浓度后，取135 μg总蛋白按常规方法进行8％ SDS-PAGE电泳并转膜，根据Marker定位保留含目的条带区域的硝酸纤维素膜并用质量分数5 %脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入封闭液稀释的抗p-ERK1/2或t-ERK1/2的Ⅰ抗，4 ℃过夜。次日漂洗3次后，加入稀释后的Ⅱ抗，室温反1 h。漂洗3次，加入DAB 显色。p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白大小约为42，44 KDa。图片分析仪扫描后，Quantity one 软件分析。
3 结果
3.1 益肾蠲湿合剂对GMC增殖的影响由表1看出，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂不同程度地抑制了血清诱导的GMC的增殖，其中以高剂量的益肾蠲湿合剂的抑制作用最为明显，抑制率在24,48和72 h分别为31.7%，39.3%和47.5%；中剂量组也显着地抑制了GMC的增殖，抑制率分别为25.9%，32.2%和40.5%；低剂量组也有效地抑制GMC的增殖，抑制率分别为13.3%，19.3%和28.3%。与对照组相比，各组在各时间点的抑制率均有统计学意义。另外，益肾蠲湿合剂的抑制作用随着作用时间的延长或剂量的增大而明显增强，存在一定的时效及量效关系。
3.2 益肾蠲湿合剂对GMC ERK1/2磷酸化的影响各组Total-ERK1 （t-ERK1） 和 Total-ERK2 （t-ERK2）的表达没有明显区别。血清所诱导GMC ERK1/2的磷酸化（p-ERK1/2）可明显被“益肾蠲湿合剂”所抑制，并且随着剂量的增加抑制作用也增强。在对p-ERK1的抑制中，低、中和高剂量组的抑制率分别为52.3%，69.8%和74.6%；对p-ERK2的抑制率分别为48.0%，68.8%和72.8%, 具有一定的量效关系。与正常对照组相比，各组均有统计学意义。
骨科护理论文 http://www.qikanba.com/
1 材料与仪器
1.1 益肾蠲湿合剂水煎液由华北煤炭医学院中西医结合医院提供。
1.2 细胞大鼠肾小球系膜细胞（HBZY 1）由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。
1.3 仪器及试剂超净工作台（美国 Forma scientific company）；倒置显微镜（日本Nikon公司）；CO2 恒温培养箱（美国 Forma scientific company）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司产品）；抗体（p-ERK1/2和t-ERK1/2）（美国 Cell Signaling）。
2 方法
2.1 含药血清的制备［4］将大鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂组。对照组给予等体积的生理盐水，益肾蠲湿合剂以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂量和低剂量。灌胃给药连续7 d，第7天重复给药两次，间隔时间2 h，并于末次给药后1 h后，眼球取血，无菌条件下分离血清，置56℃水浴30 min灭活抗体，再经0.2 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。
2.2 细胞增殖的测定检测采用四唑盐（MTT）比色法。GMC传代后，制成密度为1.5×104/ml的细胞悬液，加入96孔板内。每孔200 μl，置37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，吸弃上清液，加入无血清培养液200 μl。继续培养48 h，使绝大部分细胞处于同步（G0期）。弃上清液，分别加入DMEM 培养液（160 μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设5个复孔，分别于培养24，48和72 h时取出培养板加入MTT 20 ul（5 mg/m1），继续培养4 h，吸弃各孔培养液，加入100 μl DMSO，室温避光，轻轻振荡10 min，使结晶充分溶解后，酶标仪490 nm波长处读取OD值。
2.3 磷酸化ERK1/2（p-ERK1／2）表达的检测GMC经上诉方法同步化后，分别加入DMEM 培养液（160μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设2个复孔，培养2 h。用预冷的PBS洗涤3次，加入细胞裂解液（50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaC1，1% NP-40，0.1％ SDS，0.5% DOC，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 μmol/L leupeptin，1 μmol/L pepstatin A，1 mg/ml Laprotinin）裂解细胞，冰浴30 min后， 4℃ 10 000 r/min 离心10 min，收集上清。考马斯亮蓝染色检测总蛋白浓度后，取135 μg总蛋白按常规方法进行8％ SDS-PAGE电泳并转膜，根据Marker定位保留含目的条带区域的硝酸纤维素膜并用质量分数5 %脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入封闭液稀释的抗p-ERK1/2或t-ERK1/2的Ⅰ抗，4 ℃过夜。次日漂洗3次后，加入稀释后的Ⅱ抗，室温反1 h。漂洗3次，加入DAB 显色。p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白大小约为42，44 KDa。图片分析仪扫描后，Quantity one 软件分析。
3 结果
3.1 益肾蠲湿合剂对GMC增殖的影响由表1看出，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂不同程度地抑制了血清诱导的GMC的增殖，其中以高剂量的益肾蠲湿合剂的抑制作用最为明显，抑制率在24,48和72 h分别为31.7%，39.3%和47.5%；中剂量组也显着地抑制了GMC的增殖，抑制率分别为25.9%，32.2%和40.5%；低剂量组也有效地抑制GMC的增殖，抑制率分别为13.3%，19.3%和28.3%。与对照组相比，各组在各时间点的抑制率均有统计学意义。另外，益肾蠲湿合剂的抑制作用随着作用时间的延长或剂量的增大而明显增强，存在一定的时效及量效关系。
3.2 益肾蠲湿合剂对GMC ERK1/2磷酸化的影响各组Total-ERK1 （t-ERK1） 和 Total-ERK2 （t-ERK2）的表达没有明显区别。血清所诱导GMC ERK1/2的磷酸化（p-ERK1/2）可明显被“益肾蠲湿合剂”所抑制，并且随着剂量的增加抑制作用也增强。在对p-ERK1的抑制中，低、中和高剂量组的抑制率分别为52.3%，69.8%和74.6%；对p-ERK2的抑制率分别为48.0%，68.8%和72.8%, 具有一定的量效关系。与正常对照组相比，各组均有统计学意义。
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