树突状细胞（DC）对乳腺癌细胞的诱杀作用分析-医学综述论文
医学综述论文 医学核心期刊 护理学论文发表 临床医学论文
1 材料
人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株HT-29购自中国医学科学院肿瘤医院。rh GM-CSF、rhIL-4、rh TNF-a为美国Biosouce公司产品。人IL-12、IFN-γ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司。乳酸脱氢酶测试盒为美国Sigma公司产品。
2 方法
2.1 MCF-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养MCF-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，5 000 r/min离心20 min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原， 4℃保存备用。
2.2 树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞（PBMC），培养获得贴壁的DC前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养，分为a、b、c 3组，其中a、b组均加入rhGM-CSF 800 u/ml，rhIL-4的 1 000 u/ml和TNF-α 10 ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50 μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。
2.3 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的体外诱导Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得健康者外周血PBMC，用自制的尼龙毛柱进行分离获取T淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1 ml。分为A、B、C、D 4组：前3组分别加入上述收集的a、b、c组细胞（效应细胞与刺激细胞比为40：1），第4组（D组）加入冻融抗原50 μl，每组8个复孔。共同孵育4 d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行IFN-γ，IL-12的检测。
2.4 CTL s对乳腺癌细胞的杀伤作用将MCF-7，HT-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上A、B、C、D组CTL（效靶比40∶1），每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。24 h后离心，取上清液100 μl于4 ml Eppen-dorf管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。
2.5 IFN-γ，IL-12的检测取上述体外诱导至第6天的CTLs细胞上清液每孔100 μl，按晶美公司ELISA检测试剂盒所示方法测定IFN-γ和IL-12含量。统计学方法实验数据用 ±s表示，应用SPSS12.0统计软件统计分析。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
细胞因子IFN-γ和IL-12的检测乳腺癌细胞裂解物致敏后的DC与淋巴细胞一起培养，细胞因子IFN-γ和IL-12的含量比未致敏DC组、单纯乳腺癌细胞裂解物组和单个核细胞对照组高（P＜0.05）。 CTLs杀伤活性的检测肿瘤抗原致敏DC组诱导的CTLs对靶细胞的杀伤活性优于未致敏DC组及单核细胞组、单纯抗原组（P＜0.01）。且其对乳腺癌肿瘤细胞（MCF-7）的杀伤活性也明显优于对非乳腺癌肿瘤细胞（HT-29）的杀伤活性（P＜0.01），见表2。说明肿瘤致敏DC诱导的CTLs杀伤活性具有特异性。
护理管理杂志投稿 http://www.qikanba.com/
1 材料
人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株HT-29购自中国医学科学院肿瘤医院。rh GM-CSF、rhIL-4、rh TNF-a为美国Biosouce公司产品。人IL-12、IFN-γ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司。乳酸脱氢酶测试盒为美国Sigma公司产品。
2 方法
2.1 MCF-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养MCF-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，5 000 r/min离心20 min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原， 4℃保存备用。
2.2 树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞（PBMC），培养获得贴壁的DC前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养，分为a、b、c 3组，其中a、b组均加入rhGM-CSF 800 u/ml，rhIL-4的 1 000 u/ml和TNF-α 10 ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50 μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。
2.3 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的体外诱导Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得健康者外周血PBMC，用自制的尼龙毛柱进行分离获取T淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1 ml。分为A、B、C、D 4组：前3组分别加入上述收集的a、b、c组细胞（效应细胞与刺激细胞比为40：1），第4组（D组）加入冻融抗原50 μl，每组8个复孔。共同孵育4 d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行IFN-γ，IL-12的检测。
2.4 CTL s对乳腺癌细胞的杀伤作用将MCF-7，HT-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上A、B、C、D组CTL（效靶比40∶1），每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。24 h后离心，取上清液100 μl于4 ml Eppen-dorf管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。
2.5 IFN-γ，IL-12的检测取上述体外诱导至第6天的CTLs细胞上清液每孔100 μl，按晶美公司ELISA检测试剂盒所示方法测定IFN-γ和IL-12含量。统计学方法实验数据用 ±s表示，应用SPSS12.0统计软件统计分析。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
细胞因子IFN-γ和IL-12的检测乳腺癌细胞裂解物致敏后的DC与淋巴细胞一起培养，细胞因子IFN-γ和IL-12的含量比未致敏DC组、单纯乳腺癌细胞裂解物组和单个核细胞对照组高（P＜0.05）。 CTLs杀伤活性的检测肿瘤抗原致敏DC组诱导的CTLs对靶细胞的杀伤活性优于未致敏DC组及单核细胞组、单纯抗原组（P＜0.01）。且其对乳腺癌肿瘤细胞（MCF-7）的杀伤活性也明显优于对非乳腺癌肿瘤细胞（HT-29）的杀伤活性（P＜0.01），见表2。说明肿瘤致敏DC诱导的CTLs杀伤活性具有特异性。
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