天麻基因组DNA图谱分析-医药行业毕业论文
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1 仪器与材料
1.1 材料样品采自贵州不同地区或相同地区的不同居群，均为野生未受人为干扰状态下生长，具体类型和分布见表1；所有样品经贵阳医学院药学院生药学教研室王晓丽教授鉴定。
1.2 仪器与试剂试验中用MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA lingase、RNA酶试剂来自NEB公司，丙烯酰胺（SIGMA）、聚丙烯酰胺（SIGMA），接头和引物由上海生工生物公司合成，Taq酶、dNTP来自大连宝生物公司。DYC2-20型电泳槽、DYY-12型电泳仪（北京市六一仪器厂），PCR仪（TECHGENE）， 其余为国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 基因组DNA制备［4～7］新鲜采集的天麻块茎或地上茎切成小块后用改进的CTAB法提取基因组DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用核酸蛋白测定仪测定DNA浓度，将样品用pH8.0TE稀释后-20℃冰箱保存备用。
2.2 AFLP分析［8，9］
2.2.1 天麻基因组DNA的酶切与连接取加入45 μl如下的酶切－连接混和液：ddH2O 37.85 μl；10× NEB 2.5 μl；MseⅠ接头（50pmol·μl-1） 1 μl；PstⅠ或EcoRⅠ接头（5pmol·μl-1）1 μl；10mMATP 1μl；5μl浓度为100～200 ng·μl-1天麻基因组DNA； T4 DNA lingase（5U·μl-1）0.4 μl；MseⅠ（10 U·μl-1）0.5μl；PstⅠ或EcoRⅠ （10 U·μl-1） 0.5 μl。37℃保温过夜后取5μl酶切－连接产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。
2.2.2 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳时，先安装好垂直电泳槽然后灌入1×TBE电泳液，排除点样孔气泡，2 500 V恒压预电泳40 min。预电泳后将7 μl变性后的选扩产物上样于点样孔内，2 500 V恒压电泳至第一条指示剂条带跑至胶板底边时停止，电泳时间约2～3 h。然后银染显带［3］。
2.3 数据统计与分析AFLP电泳图谱用Gel Pro Analyzer Version 410分析，只记录那些可辨认的、两次扩增结果一致的条带，同一位点有带记为“1”，无带记为“0”，形成0/1矩阵图输入计算机，采用NTSYSpc-2.10s 软件的UPGMA方法对检测结果进行聚类，计算出天麻各样品的遗传相似度。
3 结果
3.1 天麻基因组DNA图谱结果见图1。
3.2 AFLP结果分析利用从30对引物中筛选出的8对AFLP引物对23份野生天麻种质的基因组DNA 进行片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果（见表2）。共扩增出552条谱带（100～700 bp），其中396条具有多态性，占72 %，平均每对引物扩增出69条可统计的带，其中50条具有多态性。可见，AFLP检测野生天麻种质资源遗传多样性的效率很高，也充分体现了野生天麻的遗传多样性。
3.3 遗传距离和聚类分析结果见图3。
从图3可以看出，23株野生天麻种质两两间的相似系数分布在0.57～0.85之间，其中21号与23号的相似系数最小，为0.584，表明2种质间的亲缘关系最远。2号与3号、12号与13号、19号与20号的相似系数最大，为0.85，表明这6个种质两两间的亲缘关系最近。以相似系数0.57为标准，23株野生天麻种质可分为A、B两大聚类群，其中红麻和乌麻聚在一起，黄麻和绿麻聚在一起。A聚类群在相似系数0.58附近又分为2个亚类：第1亚类包括18株，在相似系数0.66附近又分为两组，第1组有13株，全部为来自不同产地的乌麻，第2组5株全部为来自不同产地的红麻。说明野生天麻种间变异度比较小。从图3还可以看出多数来源地相同的种质表现出较为密切的亲缘关系，比如来自遵义地区的1、2、3、号聚在一起，来自德江的19、20号聚在一起等。但也有同一来源地的品种未聚在一起的情况，比如来自遵义的1、2、3、4、5、6号没有完全聚在一起。说明同一品种相同地区的种间变异度比较大。第2亚类只有1株，为乌麻品种。B聚类群包括4株，该类包含两个品种黄麻和绿麻，其中7号绿麻与10号和11号黄麻先聚在一起，再与21号绿麻聚合；7号和21号同为绿麻，但是并没有聚在一起，可能是因为产地相距较远。
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1 仪器与材料
1.1 材料样品采自贵州不同地区或相同地区的不同居群，均为野生未受人为干扰状态下生长，具体类型和分布见表1；所有样品经贵阳医学院药学院生药学教研室王晓丽教授鉴定。
1.2 仪器与试剂试验中用MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA lingase、RNA酶试剂来自NEB公司，丙烯酰胺（SIGMA）、聚丙烯酰胺（SIGMA），接头和引物由上海生工生物公司合成，Taq酶、dNTP来自大连宝生物公司。DYC2-20型电泳槽、DYY-12型电泳仪（北京市六一仪器厂），PCR仪（TECHGENE）， 其余为国产分析纯试剂。
2 方法
2.1 基因组DNA制备［4～7］新鲜采集的天麻块茎或地上茎切成小块后用改进的CTAB法提取基因组DNA，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用核酸蛋白测定仪测定DNA浓度，将样品用pH8.0TE稀释后-20℃冰箱保存备用。
2.2 AFLP分析［8，9］
2.2.1 天麻基因组DNA的酶切与连接取加入45 μl如下的酶切－连接混和液：ddH2O 37.85 μl；10× NEB 2.5 μl；MseⅠ接头（50pmol·μl-1） 1 μl；PstⅠ或EcoRⅠ接头（5pmol·μl-1）1 μl；10mMATP 1μl；5μl浓度为100～200 ng·μl-1天麻基因组DNA； T4 DNA lingase（5U·μl-1）0.4 μl；MseⅠ（10 U·μl-1）0.5μl；PstⅠ或EcoRⅠ （10 U·μl-1） 0.5 μl。37℃保温过夜后取5μl酶切－连接产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。
2.2.2 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳时，先安装好垂直电泳槽然后灌入1×TBE电泳液，排除点样孔气泡，2 500 V恒压预电泳40 min。预电泳后将7 μl变性后的选扩产物上样于点样孔内，2 500 V恒压电泳至第一条指示剂条带跑至胶板底边时停止，电泳时间约2～3 h。然后银染显带［3］。
2.3 数据统计与分析AFLP电泳图谱用Gel Pro Analyzer Version 410分析，只记录那些可辨认的、两次扩增结果一致的条带，同一位点有带记为“1”，无带记为“0”，形成0/1矩阵图输入计算机，采用NTSYSpc-2.10s 软件的UPGMA方法对检测结果进行聚类，计算出天麻各样品的遗传相似度。
3 结果
3.1 天麻基因组DNA图谱结果见图1。
3.2 AFLP结果分析利用从30对引物中筛选出的8对AFLP引物对23份野生天麻种质的基因组DNA 进行片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果（见表2）。共扩增出552条谱带（100～700 bp），其中396条具有多态性，占72 %，平均每对引物扩增出69条可统计的带，其中50条具有多态性。可见，AFLP检测野生天麻种质资源遗传多样性的效率很高，也充分体现了野生天麻的遗传多样性。
3.3 遗传距离和聚类分析结果见图3。
从图3可以看出，23株野生天麻种质两两间的相似系数分布在0.57～0.85之间，其中21号与23号的相似系数最小，为0.584，表明2种质间的亲缘关系最远。2号与3号、12号与13号、19号与20号的相似系数最大，为0.85，表明这6个种质两两间的亲缘关系最近。以相似系数0.57为标准，23株野生天麻种质可分为A、B两大聚类群，其中红麻和乌麻聚在一起，黄麻和绿麻聚在一起。A聚类群在相似系数0.58附近又分为2个亚类：第1亚类包括18株，在相似系数0.66附近又分为两组，第1组有13株，全部为来自不同产地的乌麻，第2组5株全部为来自不同产地的红麻。说明野生天麻种间变异度比较小。从图3还可以看出多数来源地相同的种质表现出较为密切的亲缘关系，比如来自遵义地区的1、2、3、号聚在一起，来自德江的19、20号聚在一起等。但也有同一来源地的品种未聚在一起的情况，比如来自遵义的1、2、3、4、5、6号没有完全聚在一起。说明同一品种相同地区的种间变异度比较大。第2亚类只有1株，为乌麻品种。B聚类群包括4株，该类包含两个品种黄麻和绿麻，其中7号绿麻与10号和11号黄麻先聚在一起，再与21号绿麻聚合；7号和21号同为绿麻，但是并没有聚在一起，可能是因为产地相距较远。
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