白英对胃癌SGC-7901细胞的诱导作用分析-关于医药销售的论文
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1 材料
人胃腺癌细胞株SGC-7901购于中科院上海细胞生物研究所。RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶为GIBCO公司产品；碘化丙啶（PI）、蛋白酶K（Proteinase K）和核糖核酸酶A（RNase A）、Hoechst 33342 为Sigma公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（上海普飞生物技术有限公司），Trizol试剂为Invitrogen公司；顺铂为锦州九泰药业有限责任公司产品；PCR引物由上海生物工程公司合成。Wellscan K3型酶标仪（KHB LAB-SYSTEMS，芬兰），PCR仪（杭州郎基公司产），DYY－6c型电泳仪（北京六一仪器厂产），紫外透射反射分析仪（上海精科实业有限公司），GIS-2009全自动数码凝胶图像分析系统。
2 方法
2.1 白英水提取物（SLT）的制备
取白英干品80 g，用800 ml水浸泡60 min，加热沸腾60 min，200目网筛过滤弃药渣，滤液以4 000 r/min的速度离心20 min× 2次，取上清液，浓缩至80 ml，调pH值为7.0～7.2，0.22 μm过滤除菌，所得液体为药物原液，生药含量为白英水提物1.0 g/ml,分装10 ml/瓶，-20℃保存备用。
2.2 细胞培养和实验分组
人胃腺癌SGC-7901细胞，以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液，在37℃，含体积分数为5% 的CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。实验分正常对照组、白英处理组和阳性对照组。其中正常对照组的培养细胞不加药物处理，只加含10% FBS的RPMI 1640培养液；白英（SLT）处理组又分3个不同剂量组，在含10%胎牛血清RPMI 1640培养液中，加入白英水提物的终浓度分别为12.5，25，50 mg/ml；阳性对照组加入含25 mg/L 顺铂的RPMI 1640培养液。
2.3 细胞毒试验（MTT法）
以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养HeLa细胞。取对数生长期细胞移入96孔培养板，细胞密度为1×104/ml，每孔加入细胞悬液200 μl，培养箱中培养24 h后，吸弃孔内原培养液，加入含白英水提物或顺铂的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200 μl。各药物浓度组分别设10个平行复孔，另设1个空白对照孔。分别培养24，48，72 h和96 h，每孔加入MTT液（5 mg/ml）20 μl，继续培养4h后终止培养，弃上清，加入二甲基亚砜150 μl终止反应，用酶标仪（波长490 nm）测定吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1－OD药物/OD对照）×100%。
2.4 SGC-7901细胞中基因bcl-xl，bid ，caspase-9和caspase-3 mRNA分析
在PUBMED上查找待检测的基因（主要是cDNA）序列和内参GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）序列，借助引物设计软件Primer Premier 5.0 设计正义和反义引物（见表1）。按Trizol Reagent试剂盒使用说明书提取SGC-7901细胞总RNA。经逆转录后，分别取cDNA产物2 μl，正、反义引物各1 μl（10 μM），2×Taq PCR Master Mix 12.5μl,加ddH2O 6.5 μl, 总反应体积25 μl。PCR反应条件： 94℃3 min; 94℃45s, 56℃45s, 72℃45s，38个循环；结束前72℃延伸10 min。然后，各取PCR产物9 μl，加10×Loading Buffer 1 μl，经1.5%琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/ml）电泳，电压为40 V，时间40 min，用紫外透射分析仪观察并拍照。通过GIS-2009全自动数码凝胶图像分析系统分析各条带的光密度，以GAPDH的表达量为对照计算并比较各组细胞中基因bcl-xl和bid mRNA的相对表达量。
3 结果
细胞毒性实验结果显示，与正常对照组相比，白英各浓度组和顺铂组处理24～96h的细胞抑制率均有显着性升高（P<0.01）（见表2, 图1）。白英水提液（SLT 12.5 mg/ml ）处理24，48，72 h和96 h的IC50分别为47.65，31.35，19.13，12.45 mg/ml。以上结果表明白英对人胃癌SGC-7901细胞增殖具有较强抑制作用，其抑制作用在一定范围内有时间－剂量依赖性。荧光显微镜观察可见：经3个不同剂量白英水提物和顺铂作用48h后，各组SGC-7901细胞呈核固缩，染色质凝聚，染色加深，呈环形或新月形附于核膜周围，并随白英剂量增加而加强，其中白英50mg/ml浓度组和顺铂组可见细胞核破碎，呈大小不等、形态不规则的荧光碎片，而正常对照组没有观察到染色质凝聚、浓染致密的颗粒块状荧光等现象（见图2）。表明白英能够诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。
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1 材料
人胃腺癌细胞株SGC-7901购于中科院上海细胞生物研究所。RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶为GIBCO公司产品；碘化丙啶（PI）、蛋白酶K（Proteinase K）和核糖核酸酶A（RNase A）、Hoechst 33342 为Sigma公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（上海普飞生物技术有限公司），Trizol试剂为Invitrogen公司；顺铂为锦州九泰药业有限责任公司产品；PCR引物由上海生物工程公司合成。Wellscan K3型酶标仪（KHB LAB-SYSTEMS，芬兰），PCR仪（杭州郎基公司产），DYY－6c型电泳仪（北京六一仪器厂产），紫外透射反射分析仪（上海精科实业有限公司），GIS-2009全自动数码凝胶图像分析系统。
2 方法
2.1 白英水提取物（SLT）的制备
取白英干品80 g，用800 ml水浸泡60 min，加热沸腾60 min，200目网筛过滤弃药渣，滤液以4 000 r/min的速度离心20 min× 2次，取上清液，浓缩至80 ml，调pH值为7.0～7.2，0.22 μm过滤除菌，所得液体为药物原液，生药含量为白英水提物1.0 g/ml,分装10 ml/瓶，-20℃保存备用。
2.2 细胞培养和实验分组
人胃腺癌SGC-7901细胞，以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液，在37℃，含体积分数为5% 的CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。实验分正常对照组、白英处理组和阳性对照组。其中正常对照组的培养细胞不加药物处理，只加含10% FBS的RPMI 1640培养液；白英（SLT）处理组又分3个不同剂量组，在含10%胎牛血清RPMI 1640培养液中，加入白英水提物的终浓度分别为12.5，25，50 mg/ml；阳性对照组加入含25 mg/L 顺铂的RPMI 1640培养液。
2.3 细胞毒试验（MTT法）
以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养HeLa细胞。取对数生长期细胞移入96孔培养板，细胞密度为1×104/ml，每孔加入细胞悬液200 μl，培养箱中培养24 h后，吸弃孔内原培养液，加入含白英水提物或顺铂的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200 μl。各药物浓度组分别设10个平行复孔，另设1个空白对照孔。分别培养24，48，72 h和96 h，每孔加入MTT液（5 mg/ml）20 μl，继续培养4h后终止培养，弃上清，加入二甲基亚砜150 μl终止反应，用酶标仪（波长490 nm）测定吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1－OD药物/OD对照）×100%。
2.4 SGC-7901细胞中基因bcl-xl，bid ，caspase-9和caspase-3 mRNA分析
在PUBMED上查找待检测的基因（主要是cDNA）序列和内参GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）序列，借助引物设计软件Primer Premier 5.0 设计正义和反义引物（见表1）。按Trizol Reagent试剂盒使用说明书提取SGC-7901细胞总RNA。经逆转录后，分别取cDNA产物2 μl，正、反义引物各1 μl（10 μM），2×Taq PCR Master Mix 12.5μl,加ddH2O 6.5 μl, 总反应体积25 μl。PCR反应条件： 94℃3 min; 94℃45s, 56℃45s, 72℃45s，38个循环；结束前72℃延伸10 min。然后，各取PCR产物9 μl，加10×Loading Buffer 1 μl，经1.5%琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/ml）电泳，电压为40 V，时间40 min，用紫外透射分析仪观察并拍照。通过GIS-2009全自动数码凝胶图像分析系统分析各条带的光密度，以GAPDH的表达量为对照计算并比较各组细胞中基因bcl-xl和bid mRNA的相对表达量。
3 结果
细胞毒性实验结果显示，与正常对照组相比，白英各浓度组和顺铂组处理24～96h的细胞抑制率均有显着性升高（P<0.01）（见表2, 图1）。白英水提液（SLT 12.5 mg/ml ）处理24，48，72 h和96 h的IC50分别为47.65，31.35，19.13，12.45 mg/ml。以上结果表明白英对人胃癌SGC-7901细胞增殖具有较强抑制作用，其抑制作用在一定范围内有时间－剂量依赖性。荧光显微镜观察可见：经3个不同剂量白英水提物和顺铂作用48h后，各组SGC-7901细胞呈核固缩，染色质凝聚，染色加深，呈环形或新月形附于核膜周围，并随白英剂量增加而加强，其中白英50mg/ml浓度组和顺铂组可见细胞核破碎，呈大小不等、形态不规则的荧光碎片，而正常对照组没有观察到染色质凝聚、浓染致密的颗粒块状荧光等现象（见图2）。表明白英能够诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。
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