超高压水射流技术对葛根药材化学成分影响研究-基础医学论文
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1 仪器与材料
LC-20AT高效液相色谱仪，包括LC-20AT泵、SPD-20A紫外检测器、AT-330柱温箱、Class-VP数据处理系统、7725i进样阀（日本岛津公司）；DPSB-3040型超高压水射流系统（南京大地水刀股份有限公司）。
葛根为市售，经本院王盛民教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata Ohwi的干燥根；葛根素对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511）；甲醇为HPLC级（美国Fisher公司）；所用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备称取葛根药材粗粉约500 g，精密称定，10倍量80%的乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，溶液定容至2 000 ml。量取葛根提取液200 ml，用超纯水稀释至20 L，分别在150，200，250，300和350 MPa压力条件下，经超高压水射流处理，将各溶液摇匀、静置，分别取未经处理和各处理液的上清液过0.45 μm微孔滤膜，标号为0，1，2，3，4，5号，作为供试品溶液。
2.2 对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品12.0 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀；精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升含葛根素96 μg）。
2.3 葛根的薄层色谱鉴别照薄层色谱法实验［2］，吸取“2.1”和“2.2”项制备的供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，展开，取出晾干，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。斑点较为圆整，分离效果好，各供试品斑点大小及Rf值无显着差异。
2.4 HPLC色谱条件Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（美国Waters）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（25∶75）；检测波长250 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μl。在该色谱条件下，理论塔板数按葛根素峰计算不低于4 000，且样品中葛根素与其他组分分离良好，对照品及样品的色谱图见图1。
2.5 线性关系考察分别精密吸取“2.2”项下制备的葛根素对照品溶液2，4，6，8，10 μl进样测定，记录各峰面积。以葛根素进样量（μg）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得回归方程Y=704 877.60X-653.88，r=0.999 9。结果表明葛根素在0.192～0.960 μg浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。
2.6 精密度实验精密吸取葛根素对照品溶液10 μl，重复进样5次，测定峰面积，得RSD为1.65%。稳定性实验取“2.1”项未经超高压水射流处理的供试品溶液，同法分别于2，4，6，8，24 h测定，进样10 μl/次，结果RSD为1.37%，表明样品在24 h内稳定。重复性实验取同一批样品粉末，按样品含量测定法同法测定5次，RSD为2.38%，表明该测定方法重复性比较好。加样回收实验采用加样回收法，称取已知含量的葛根药材5份，精密称定，再分别精密加入葛根素对照品溶液 （0.20 mg·ml-1）20 ml，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μl，记录色谱图，结果葛根素平均回收率为96.1%，RSD为1.14%（n=5）。
本文研究结果表明，不同压力的水射流处理葛根醇提液后，处理液的温度由进样温度19.8℃随压力的升高上升至51.8℃；葛根的薄层图谱中斑点的个数、大小及Rf值无明显差别；葛根的液相图谱中峰的个数及形状亦无明显差别，作为葛根药材的指标性成分葛根素，其含量均符合药典规定。经过150，200，250，300 和350 MPa不同压力水射流处理液中葛根素的含量都较原液升高，尤其以经350 MPa压力水射流处理液中葛根素含量最高，其原因可能是，由于葛根素本来就存在于葛根最外部的木栓层下的外部薄壁组织中，经过超高压水射流技术的瞬时卸压、高速撞击、高剪切和热协同作用产生膨化效应，破坏了药材中微生物的细胞壁及细胞膜，同时引发对压力敏感的非共价键（氢键、离子键、疏水键等）的破坏［5］，使得葛根素更容易浸出 。
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LC-20AT高效液相色谱仪，包括LC-20AT泵、SPD-20A紫外检测器、AT-330柱温箱、Class-VP数据处理系统、7725i进样阀（日本岛津公司）；DPSB-3040型超高压水射流系统（南京大地水刀股份有限公司）。
葛根为市售，经本院王盛民教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata Ohwi的干燥根；葛根素对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511）；甲醇为HPLC级（美国Fisher公司）；所用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备称取葛根药材粗粉约500 g，精密称定，10倍量80%的乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，溶液定容至2 000 ml。量取葛根提取液200 ml，用超纯水稀释至20 L，分别在150，200，250，300和350 MPa压力条件下，经超高压水射流处理，将各溶液摇匀、静置，分别取未经处理和各处理液的上清液过0.45 μm微孔滤膜，标号为0，1，2，3，4，5号，作为供试品溶液。
2.2 对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品12.0 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀；精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升含葛根素96 μg）。
2.3 葛根的薄层色谱鉴别照薄层色谱法实验［2］，吸取“2.1”和“2.2”项制备的供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，展开，取出晾干，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。斑点较为圆整，分离效果好，各供试品斑点大小及Rf值无显着差异。
2.4 HPLC色谱条件Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（美国Waters）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（25∶75）；检测波长250 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μl。在该色谱条件下，理论塔板数按葛根素峰计算不低于4 000，且样品中葛根素与其他组分分离良好，对照品及样品的色谱图见图1。
2.5 线性关系考察分别精密吸取“2.2”项下制备的葛根素对照品溶液2，4，6，8，10 μl进样测定，记录各峰面积。以葛根素进样量（μg）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得回归方程Y=704 877.60X-653.88，r=0.999 9。结果表明葛根素在0.192～0.960 μg浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。
2.6 精密度实验精密吸取葛根素对照品溶液10 μl，重复进样5次，测定峰面积，得RSD为1.65%。稳定性实验取“2.1”项未经超高压水射流处理的供试品溶液，同法分别于2，4，6，8，24 h测定，进样10 μl/次，结果RSD为1.37%，表明样品在24 h内稳定。重复性实验取同一批样品粉末，按样品含量测定法同法测定5次，RSD为2.38%，表明该测定方法重复性比较好。加样回收实验采用加样回收法，称取已知含量的葛根药材5份，精密称定，再分别精密加入葛根素对照品溶液 （0.20 mg·ml-1）20 ml，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μl，记录色谱图，结果葛根素平均回收率为96.1%，RSD为1.14%（n=5）。
本文研究结果表明，不同压力的水射流处理葛根醇提液后，处理液的温度由进样温度19.8℃随压力的升高上升至51.8℃；葛根的薄层图谱中斑点的个数、大小及Rf值无明显差别；葛根的液相图谱中峰的个数及形状亦无明显差别，作为葛根药材的指标性成分葛根素，其含量均符合药典规定。经过150，200，250，300 和350 MPa不同压力水射流处理液中葛根素的含量都较原液升高，尤其以经350 MPa压力水射流处理液中葛根素含量最高，其原因可能是，由于葛根素本来就存在于葛根最外部的木栓层下的外部薄壁组织中，经过超高压水射流技术的瞬时卸压、高速撞击、高剪切和热协同作用产生膨化效应，破坏了药材中微生物的细胞壁及细胞膜，同时引发对压力敏感的非共价键（氢键、离子键、疏水键等）的破坏［5］，使得葛根素更容易浸出 。
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