高纯水芹菜黄酮提取物工艺研究-生物制药论文
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1 材料与仪器
1.1 材料及处理水芹菜采于湖北民族学院后山。将新鲜水芹菜洗净，于60℃烘箱中烘干，粉碎，过孔径60目筛，装于棕色试剂瓶备用。
1.2 药品大孔吸附树脂NKA、NKA-9、X-5、AB-8（天津南开大学生产）；芦丁标准品（进口分装），95%乙醇， 亚硝酸钠， 硝酸铝，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器AL204电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），LXJ-ⅡB离心机（上海安亭科学仪器厂制造）， RE-201D旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司），可见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）。
2 方法
2.1 树脂的预处理［9］将各种大孔吸附树脂，分别用95%的乙醇浸泡24 h，并不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分接触，以便从孔中赶出空气。将浸泡好的树脂上柱先用95%的乙醇冲洗，直至流出液无白色为止。然后用2 BV（2倍的上柱的大孔树脂的体积）的4%的NaOH冲洗，并关闭30 min，用蒸馏水洗至中性。再用2 BV的5%HCl冲洗 ，并关闭30 min，最后用蒸馏水洗至中性，处理完毕后用蒸馏水浸泡保存。
2.2 水芹菜黄酮粗提液的制备称取一定量的样品，料液比1∶35，乙醇浓度80%，在90℃的水浴锅中回流提取2.5h，5 000 r/min离心15 min，取其上清液。将上清液在旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液5 000 r/min离心15 min，取其上清液，即得到黄酮粗提液。
2.3 水芹菜黄酮测定方法［10］水芹菜黄酮含量测定采用以芦丁为对照品的NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色比色法。
2.4 大孔树脂静态吸附称取各种滤干湿大孔树脂1 g，放入相同型号的烧杯中，加入黄酮粗提液20 ml，放入电动振荡器上，振荡吸附24 h，过滤，吸取吸附后的溶液0.4 ml测其吸光度，计算出树脂在室温下的吸附量和吸附率。取吸附饱和的树脂，加入80%的乙醇20 ml，浸泡振摇4 h，过滤，取解吸后的溶液0.3 ml，测定滤液中黄酮的浓度，根据黄酮解吸量计算解吸率。
2.5 AB-8大孔树脂动态吸附上柱速率测定：取处理好的AB-8大孔吸附树脂8g，装柱约10 cm高。将6份50 ml 0.3mg·ml-1的黄酮粗提液分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，80%乙醇5 BV洗脱，然后测定其吸附率。
乙醇解吸浓度确定：将5份50 ml 0.3 mg ·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，分别用5 BV20%，40%，60%，80%，95%的乙醇进行洗脱，然后测其解吸率。乙醇洗脱体积确定：将6份50 ml 0.3 mg·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，分别用80%的乙醇2，4，5，6，7，8 BV进行洗脱，然后测其解吸率。乙醇洗脱速率测定：将5份50 ml 0.3mg·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1的速率进行洗脱，洗脱剂为80%的乙醇5 BV，然后测其解吸率。
3 结果
上样速率的选择上样速率一般都要求较慢，这是因为流速过快，吸附效果差，吸附不完全。但是流速过慢，会延长生产周期，增加成本。因此有必要选择一个合适的上样速率使之既能达到一定的吸附率又能尽可能的节约时间。实验按“2.5”项的方法测定了上样速率对吸附效果的影响，（见表4）。吸附率随上样速率的增快而降低，黄酮吸附率和上样流速呈极显着线性负相关，线性回归方程为：Y=-4.314 8X+83.809 3（Y：吸附率%，X：上样流速ml·min-1）。但是在综合考虑吸附率和应用于生产中的周期长短，选取 1.5ml·min-1的上样流速。
乙醇洗脱体积的选择在确定了乙醇的最佳浓度之后，进一步对洗脱液的最佳用量进行了确定，其原则是在充分洗脱所吸附黄酮的前提下，尽量节省洗脱剂的用量。从表6可以看出，当乙醇的洗脱用量达到5 BV时，解吸率为73.22.%，超过5 BV时，解吸率基本不再增加。因此，本实验所采用的乙醇洗脱体积为5 BV。
树脂的富集能力配制黄酮浓度为0.3 mg·ml-1的黄酮水溶液50 ml，以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，以1.0 ml·min-1的速率进行洗脱，洗脱剂为80%的乙醇50 ml。收集流出液、水洗液及解吸液，测得解吸液黄酮浓度为0.212 mg·ml-1。分别取20 ml上柱前黄酮浓度为0.3 mg·ml-1的黄酮水溶液和上柱后的解吸液，在旋转蒸发仪中浓缩，烘干，冷却。测得纯化前黄酮纯度为9.98%，纯化后纯度为25.8%，黄酮回收率为70.53%。
本实验主要对4种不同型号的大孔吸附树脂NKA、NKA-9、X-5、AB-8对水芹菜黄酮粗提物的静态吸附和解吸性质进行了研究，发现AB-8大孔吸附树脂在几种常用的用于富集黄酮的大孔树脂中吸附与解吸能力最好，并通过动态吸附实验对上样速率、解吸液浓度、解吸液体积及洗脱速率进行了研究，确定该树脂的最佳条件为：以1.5 ml·min-1的流速上样后，然后用5BV80%的乙醇以1.0 ml·min-1的速率洗脱。
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1 材料与仪器
1.1 材料及处理水芹菜采于湖北民族学院后山。将新鲜水芹菜洗净，于60℃烘箱中烘干，粉碎，过孔径60目筛，装于棕色试剂瓶备用。
1.2 药品大孔吸附树脂NKA、NKA-9、X-5、AB-8（天津南开大学生产）；芦丁标准品（进口分装），95%乙醇， 亚硝酸钠， 硝酸铝，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器AL204电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），LXJ-ⅡB离心机（上海安亭科学仪器厂制造）， RE-201D旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司），可见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）。
2 方法
2.1 树脂的预处理［9］将各种大孔吸附树脂，分别用95%的乙醇浸泡24 h，并不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分接触，以便从孔中赶出空气。将浸泡好的树脂上柱先用95%的乙醇冲洗，直至流出液无白色为止。然后用2 BV（2倍的上柱的大孔树脂的体积）的4%的NaOH冲洗，并关闭30 min，用蒸馏水洗至中性。再用2 BV的5%HCl冲洗 ，并关闭30 min，最后用蒸馏水洗至中性，处理完毕后用蒸馏水浸泡保存。
2.2 水芹菜黄酮粗提液的制备称取一定量的样品，料液比1∶35，乙醇浓度80%，在90℃的水浴锅中回流提取2.5h，5 000 r/min离心15 min，取其上清液。将上清液在旋转蒸发仪中浓缩，浓缩液5 000 r/min离心15 min，取其上清液，即得到黄酮粗提液。
2.3 水芹菜黄酮测定方法［10］水芹菜黄酮含量测定采用以芦丁为对照品的NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色比色法。
2.4 大孔树脂静态吸附称取各种滤干湿大孔树脂1 g，放入相同型号的烧杯中，加入黄酮粗提液20 ml，放入电动振荡器上，振荡吸附24 h，过滤，吸取吸附后的溶液0.4 ml测其吸光度，计算出树脂在室温下的吸附量和吸附率。取吸附饱和的树脂，加入80%的乙醇20 ml，浸泡振摇4 h，过滤，取解吸后的溶液0.3 ml，测定滤液中黄酮的浓度，根据黄酮解吸量计算解吸率。
2.5 AB-8大孔树脂动态吸附上柱速率测定：取处理好的AB-8大孔吸附树脂8g，装柱约10 cm高。将6份50 ml 0.3mg·ml-1的黄酮粗提液分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，80%乙醇5 BV洗脱，然后测定其吸附率。
乙醇解吸浓度确定：将5份50 ml 0.3 mg ·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，分别用5 BV20%，40%，60%，80%，95%的乙醇进行洗脱，然后测其解吸率。乙醇洗脱体积确定：将6份50 ml 0.3 mg·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，分别用80%的乙醇2，4，5，6，7，8 BV进行洗脱，然后测其解吸率。乙醇洗脱速率测定：将5份50 ml 0.3mg·ml-1的黄酮粗提液分别以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml·min-1的速率进行洗脱，洗脱剂为80%的乙醇5 BV，然后测其解吸率。
3 结果
上样速率的选择上样速率一般都要求较慢，这是因为流速过快，吸附效果差，吸附不完全。但是流速过慢，会延长生产周期，增加成本。因此有必要选择一个合适的上样速率使之既能达到一定的吸附率又能尽可能的节约时间。实验按“2.5”项的方法测定了上样速率对吸附效果的影响，（见表4）。吸附率随上样速率的增快而降低，黄酮吸附率和上样流速呈极显着线性负相关，线性回归方程为：Y=-4.314 8X+83.809 3（Y：吸附率%，X：上样流速ml·min-1）。但是在综合考虑吸附率和应用于生产中的周期长短，选取 1.5ml·min-1的上样流速。
乙醇洗脱体积的选择在确定了乙醇的最佳浓度之后，进一步对洗脱液的最佳用量进行了确定，其原则是在充分洗脱所吸附黄酮的前提下，尽量节省洗脱剂的用量。从表6可以看出，当乙醇的洗脱用量达到5 BV时，解吸率为73.22.%，超过5 BV时，解吸率基本不再增加。因此，本实验所采用的乙醇洗脱体积为5 BV。
树脂的富集能力配制黄酮浓度为0.3 mg·ml-1的黄酮水溶液50 ml，以1.5 ml·min-1的速率进行上柱，再用5 BV的水洗柱，以1.0 ml·min-1的速率进行洗脱，洗脱剂为80%的乙醇50 ml。收集流出液、水洗液及解吸液，测得解吸液黄酮浓度为0.212 mg·ml-1。分别取20 ml上柱前黄酮浓度为0.3 mg·ml-1的黄酮水溶液和上柱后的解吸液，在旋转蒸发仪中浓缩，烘干，冷却。测得纯化前黄酮纯度为9.98%，纯化后纯度为25.8%，黄酮回收率为70.53%。
本实验主要对4种不同型号的大孔吸附树脂NKA、NKA-9、X-5、AB-8对水芹菜黄酮粗提物的静态吸附和解吸性质进行了研究，发现AB-8大孔吸附树脂在几种常用的用于富集黄酮的大孔树脂中吸附与解吸能力最好，并通过动态吸附实验对上样速率、解吸液浓度、解吸液体积及洗脱速率进行了研究，确定该树脂的最佳条件为：以1.5 ml·min-1的流速上样后，然后用5BV80%的乙醇以1.0 ml·min-1的速率洗脱。
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