仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌的作用研究_关于康复治疗的论文

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肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方，具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效，多年的临床应用已证实其具有较好的临床疗效［1-2］。本研究通过动物实验，进一步研究了仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用，并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 C57BL/6J小鼠，雌雄各半，体质量18～22g，SPF级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：0020535）。

　　1.2 瘤株小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供，广州中医药大学第一附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。

　　1.3 药物与制备仙鱼汤组成：仙鹤草15g，鱼腥草30g，猫爪草30g ，山海螺30g，党参15g，三七片10g，山慈菇10g，浙贝母15g，守宫5g，天冬15g，黄芪30g，炙甘草5g。由广州中医药大学新药研究中心制备，按照传统煎煮法煎煮，低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表面积与计量换算法计算［3］，低剂量组1.092g/mL，中剂量组2.184g/mL，高剂量组4.368g/mL，分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍。制备后于4℃冰箱中贮存备用。环磷酰胺（CTX）注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品（批号：20060206），200mg/支，临用前用生理盐水溶解，稀释浓度为2mg/mL，根据CTX的半数致死量（LD50）为472mg/kg，注射用量为LD50的1/3～1/5，故小鼠给药剂量设为20mg·kg-1·d-1。

　　1.4 主要试剂与仪器碘化丙啶（PI）染液为晶美生物工程有限公司产品；bcl　2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色（SABC）试剂盒（SA1022）均为博士德生物工程有限公司产品；RPMI　1640培养基为Gibco公司产品；二甲苯、乙醇，均为市售分析纯；超净工作台（苏净集团安泰公司）；冷冻桌面离心机（Eppendorf 5810R Centrifuge）；解剖显微镜（北京电子光学设备厂）；37℃电热恒温水浴箱（上海恒丰仪器仪表有限公司）；ALTRA型流式细胞仪（美国Beckman coulter公司）；CS　Ⅳ型烤片机（孝感市电子仪器厂）；亿鸣　200病理图像分析系统（中国亿鸣）。

　　1.5 Lewis肺癌荷瘤小鼠模型复制于液氮罐中取出Lewis肺癌细胞株1支，置于37℃电热恒温水浴箱内，轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加体积分数10％小牛血清RPMI　1640培养基，常规离心，制成瘤细胞混悬液，台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。消毒小鼠右前腋，取0.2mL（约1×106～2×106个瘤细胞）接种于皮下。传代3次。在无菌条件下剥离Lewis肺癌荷瘤鼠皮下瘤块，选取生长良好的瘤组织，剪碎、称质量，用细胞匀浆器制成匀浆，按体积比1：3加生理盐水制成瘤细胞混悬液，接种于C57BL/6J小鼠右前肢腋窝皮下，每只0.2mL（约1×106～2×106个瘤细胞）。

　　1.6 分组及给药接种24h后随机分为5组:仙鱼汤高剂量组（剂量为1.747g/kg）、仙鱼汤中剂量组（剂量为0.874g/kg）、仙鱼汤低剂量组（剂量为0.437g/kg）、CTX阳性对照组（剂量为20mg/kg）、荷瘤模型组。中药各组均予以0.4mL中药灌胃，CTX组予以0.2mL腹腔注射，荷瘤模型组予以0.4mL生理盐水灌胃，均每日1次，给药14d。

　　1.7 观察指标及检测方法

　　1.7.1 小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。

　　1.7.2 抑瘤率末次给药后24h，Lewis荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，用眼科剪分离剥取肿瘤，电子天平称质量，计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率［4］：p抑瘤=（1－m实验组/m模型组）×100%。

　　1.7.3 细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织，加入生理盐水洗净血迹后倒掉，再加入1mL生理盐水，用眼科剪剪碎组织，吸管轻轻吹打，过300目筛，收集单细胞悬液于流式专用管，加入2mL中性磷酸盐缓冲溶液（PBS），1 300r/min离心5min洗涤2次，调整细胞计数约1×106/mL，加入体积分数70％冰乙醇2mL吹打后封口固定，保存于4℃冰箱24h。将固定的单细胞悬液离心，去固定液，加入PBS重新悬浮，洗涤2次，300目筛网过滤1次，加入1mL PI染液（终浓度100mg/L），4℃避光染色30min，流式细胞仪检测，收集50　000个细胞，应用multicycle软件分析凋亡率［5］。

　　1.7.4 病理检查肿瘤组织经体积分数10％福尔马林固定24h后常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。

　　1.7.5 bcl　2阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后，4μm厚连续切片，行SABC法免疫组织化学染色，用PBS液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察，bcl　2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野（400）下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数（staining intensity index ，pSII）。pSII＝（pA强度瘤细胞×0）＋（pB强度瘤细胞×1）＋（pC强度瘤细胞×2）＋（pD强度瘤细胞×3）。其中A强度代表细胞浆无特异性染色；B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色，染色较浅；C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色；D强度代表细胞浆呈特异性深棕色，染色较深。染色强度指数（pSII）的范围在0～3 ［6］。

　　1.8 统计学分析采用SPSS 11.5统计软件处理。

　　2 结果

　　2.1 一般状况的观察实验结束后，模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小，活动少，喜聚群，毛发缺少光泽；CTX组小鼠于实验5～7d开始出现脱毛，进食减少；仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组，活动力优于CTX组及模型组。

　　2.2 各组抑瘤率比较表1结果表明，仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１）。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大，瘤体质量逐渐减轻，抑瘤率逐渐增高。
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