建立脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法 2012年教育期刊征稿

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　　细菌性脑脊髓膜炎是一种发病急、病死率高的常见的中枢神经系统疾病，需要及时有效的治疗，而其有效治疗主要取决于对脑脊液中感染的病原菌进行快速而准确的检测和鉴定。目前临床实验室采用的传统细菌培养鉴定方法敏感性低，检测周期长，且受抗生素应用、病原菌自身生理条件等各方面的限制，不能满足临床快速诊断的要求。近年来发展起来的基因芯片技术以其高通量、快速等优点为解决上述问题提供了一条新的途径;但该技术成本高，需要点样仪和扫描仪等特殊仪器设备，因而在临床实验室的实际操作中的应用还比较局限。而以硝酸纤维膜和尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金显色等简便检测手段则方便了寡核苷酸芯片技术在各领域的应用。本研究根据基因芯片的基本原理，并结合临床实验室的具体要求，探讨建立一种简易的检测脑脊液标本感染病原菌的寡核苷酸芯片（又称宏观矩阵）。现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 细菌菌株根据脑脊液病原菌的流行病学调查结果，初步选取以下7种常见的病原菌进行研究。大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、脑膜炎奈瑟菌（ATCC 13077）、表皮葡萄球菌（ATCC 12228）、绿脓假单胞菌（ATCC 25668），以及对照菌白色念珠菌（ATCC 14053）标准菌株均由中国药品与生物制品鉴定所提供，肺炎链球菌、产单核李斯特菌等标准菌株或临床分离菌株为本室保存。
　
　　1.2 脑脊液模拟感染标本的制作将上述细菌接种至响应液体培养基中，37 ℃培养至对数生长期，取一定量菌液与经验证无菌的脑脊液混均后作为脑脊液模拟感染标本。

　　1.3 引物及探针参照文献［5，6］，在GenBank查得多种常见细菌16S rRNA基因序列，用DNAstar软件进行分析比较，在保守区用PrimerPremier软件各寻找一段大多数常见细菌共有保守序列作为通用引物。根据该上、下游引物之间的变异区序列分别设计各特异性探针。设计的探针主要包括:所有细菌的通用探针，革兰阳性（G+ ）菌的通用探针，革兰阴性（G- ）菌的通用探针，肠杆菌科的属特异性探针、绿脓假单胞菌特异性探针、金黄色葡萄球菌的特异性探针、凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）的特异性探针、肺炎链球菌的特异性探针，以及产单核李斯特菌的特异性探针等共11种。

　　1.4 寡核苷酸芯片的制备取上述各探针（50 μmol/L）4 μL，在20 μL的反应体系中用末端转移酶TDT（美国Promega公司）以dTTP为底物在3′端加尾，取加尾后的探针各0.5 μL按照固定顺序点于尼龙膜上（Zeta-Probe，Bio-Rad公司）， 80 ℃固定2 h;用缓冲液（ 5× SSPE， SDS）漂洗去除未连接的寡核苷酸探针，干燥后保存备用。
　　
　　1.5 细菌DNA提取取制备的各脑脊液模拟感染标本，应用基因组DNA提取试剂盒（Wizard Genomic DNA Purifica-tion Kit，美国Promega公司）提取细菌DNA。

　　1.6 UP-PCR扩增与Biotin标记参照文献［6］的方法并进行改进。PCR混合液（ 50 μL ）组成如下:模板2.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL ，MgCl 22.5 mmol/L，dATP、dCTP、dGTP各200 nmol/L，dTTP 135 nmol/L，Biotin-16-dUT 65 nmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L。扩增条件:94 ℃预变性 6 min后，94 ℃ 45 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。取PCR产物琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

　　1.7 分子杂交与检测将PCR阳性产物100 ℃变性10 min后立刻放冰浴1 min;然后加入到1.5 mL杂交液中混匀，加入制备的寡核苷酸芯片50 ℃杂交3 h;杂交完毕后，用洗涤液（ 2×SSC ）室温下漂洗 5 min ;然后依次用2× SSC室温下、0.1×SSC 37 ℃和65 ℃振荡漂洗各15 min。显色时先加入30 g/L的BSA室温下作用15 min，弃去液体;然后加适量碱磷酶标记链霉亲合素溶液室温作用10 min，弃去SA-AP液，用洗膜缓冲液室温洗3～5次，最后将寡核苷酸芯片置一新杂交槽中，加入NBT/BCIP底物工作液，室温下避光显色。
　　
　　2 结果

　　2.1 UP-PCR扩增部分标准菌株及本室保存菌株提取DNA后，进行UP-PCR扩增，结果均获得372 bp左右的产物，与设计相符。
　　
　　2.2寡核苷酸芯片对含7种常见病原菌脑脊液模拟感染标本的检测将变性的各种PCR产物分别与芯片进行分子杂交，7种细菌均能与细菌通用探针产生杂交信号;金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌和产单核李斯特菌都能与G+ 菌探针产生杂交信号，而与G- 菌探针无杂交信号;大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、绿脓假单胞菌均与G- 菌探针产生杂交信号，而与G+ 菌探针则无杂交信号。金黄色葡萄球菌与其相应特异性探针杂交，而与凝固酶阴性葡萄球菌探针不反应;表皮葡萄球菌则与凝固酶阴性葡萄球菌特异性探针杂交，而与金黄色葡萄球菌探针不反应。大肠埃希菌与肠杆菌科特异性探针杂交。所有细菌均未与阴性对照探针产生杂交信号。见图2。

　　3 讨论

　　目前，国内外对脑脊液等临床标本中病原菌的检验大多采用所谓的“金标准” 培养法，一般采集标本后需先进行增菌，出现阳性结果后，再分离单个菌落，通过形态、生理生化、免疫学等方法才能最终确诊。该法灵敏度低、检测周期长、易受细菌生理条件和抗生素使用的限制，且不能用于目前还不能培养细菌或新菌种的鉴定。基因芯片具有体积微小、操作方便、能同时特异检测多种生物分子等优点，为解决上述问题提供了一个新的方向［2，3］。但该技术制作成本高，需要昂贵的仪器设备和熟练的专业技术操作;此外，多数芯片上集中了上千个靶点，多用于大规模的分析和筛查。但在临床疾病的诊断中，尤其是病原体的常规检测中，一般某一种标本中待筛查的种类仅在十几～几十种，因此没有必要使用如此高的密集度。因此，该技术在一段时间内主要用于生命科学的基础研究和药物开发领域，在临床实验室的实际操作中的应用还比较局限。本研究根据基因芯片的设计理念和基本原理，对芯片技术在临床标本的实际检测中进行了一些初步探索，旨在建立一种准确、快速、高效且符合临床实验室实际需求的检测技术。本研究根据细菌16S rRNA基因兼有保守性和变异性的特征［7］，设计出能扩增所有细菌的通用引物及探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及初步确定的几种脑脊液常见病原菌的鉴定探针，加尾后固定于尼龙膜上，制成简易寡核苷酸芯片。提取各病原菌DNA后UP-PCR扩增，确定标本是否有细菌感染，并扩增过程中用Bio-16-dUTP标记扩增产物。将阳性扩增产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交，然后用碱磷酶标记链霉亲合素和NBT/BCIP底物进行显色，对疑为细菌感染的病人脑脊液标本进行快速检测。该方法操作简单，结果观察方便，不需要特殊仪器设备，避免了放射性核素的放射性危险。研究设计的探针中，UP的用途是进一步验证标本中细菌的存在，更主要的是起到阳性对照的作用。革兰阳性菌和阴性菌的探针可将细菌按照染色特性进行初步鉴定。肠杆菌科、嗜血杆菌属探针具有科或属的特异性;金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的探针则具有种的特异性，能将细菌鉴定到种;凝固酶阴性葡萄球菌的探针则能代替凝固酶实验将葡萄球菌进行区分。寡核苷酸芯片以尼龙膜为载体，制备完成后可长时间稳定保存，因此芯片可预先大量制备好。使用时可在1个工作日完成所有的检测工作，真正实现快速早期诊断的目的，并极利于该技术的商品化。检测完毕后结果可长时间存档，更能适合临床的实际需求。此外，本技术的一个特点是，可以根据使用者所在地域、医院细菌性脑膜炎病原菌的流行和分布情况不同，在芯片上自由组合各种探针，使检测成本降低，具有较高的灵活性。尽管各方面的研究已经在方法学上证实了该芯片的可行性，但若将之完善还有很多工作要做。点膜技术、杂交条件、试剂的成分都可能直接影响到该方法的稳定性，最终建立成熟的技术体系，还需要继续研究探索。
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