探讨宫颈癌对Eag1钾离子通道的影响-城镇居民医疗保险论文
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1 资料与方法
1.1 一般资料 标本全部来自第三军医大学第三附属医院妇产科1995年12月-2008年12月诊治的病例，全部标本均经我院病理科诊断并证实，患者年龄24～77岁，平均46岁。
1.2 细胞准备
1.2.1 细胞培养 Hela细胞为本室培养的细胞株。使用含10%小牛血清的DMEM培养基，置于5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度的孵箱内培养。
1.2.2 缺氧模型 观察细胞70%～90%融合，在无菌条件下弃去大部分培养液。将混合气体（含90%N2、5%CO2、5%O2）以10L/min流量充入密闭容器，持续20min，同时关闭进气口和出气口，抽取气体经血气分析仪检测容器内O2浓度小于5%。
1.3 Eag1表达的检测
1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人Eag1单克隆抗体购自sigma公司。组织标本常规石蜡包埋，制成4μm厚切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），微波炉加热至沸后断电，间隔10min重复两次，冷却后0.02M PBS洗涤，抗原修复液修复抗原，山羊血清封闭后不洗，滴加1:150稀释的Eag1单克隆抗体，4℃过夜，0.02M PBS洗后加生物素标记羊抗兔二抗，30℃染色20min后，DAB显色，苏木素轻度复染，二甲苯透明，封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。
1.3.2 判断标准 Eag1主要定位于胞浆和（或）胞膜。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对Eag1表达做半定量评定[3]。按阳性细胞率评分：阳性细胞数占<11%为1分； 11%～50%为2分； 51%～80%为3分；>80%为4分。按显色程度评分：染色弱为1分；中等染色为2分；强染色为3分。然后将两种评分结合起来分为4级：无论染色强度如何，细胞阳性率≤10%为阴性；评2或3分者为弱阳性（+）；评4或5分为中度阳性（++）；6或7分为强阳性（+++）。若1例标本有2个染色结果，则取1个纳入统计。
1.5 全细胞膜片钳法检测Hela细胞缺氧后钾离子通道改变 应用电极拉制器用两步法拉制玻璃毛细管电极。应用Axon公司的pClamp软件中的Clampex采集数据，采样频率为10kHz，滤波频率为1～5kHz。PClamp软件输出刺激命令给膜片钳放大器，通过探头、记录电极施加到细胞内，用于钳制细胞膜电位和诱发钾离子通道电流。
1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件对结果进行处理，组间比较采用χ2检验，Fisher确切概率法计算P值，膜片钳实验获得的全部数据均用pClampB 9.0（Axon Ins，USA）软件进行分析处理，计量资料采用t检验和方差分析，P<0.05为差异有显着性，P<0.01表示为差异有非常显着性。
2 结果
Eag1在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变及宫颈鳞癌中的表达 Eag1在3种组织中均为细胞质、胞膜表达，细胞核未见表达。Eag1在慢性宫颈炎及宫颈上皮内瘤变中呈轻度着色，Eag1在宫颈鳞癌中呈中强度着色，阳性信号弥漫分布于癌巢内（图1、2、3）。Eag1在宫颈鳞癌中的表达率明显高于慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤样变组，宫颈上皮内瘤样组内Eag1表达率明显高于慢性宫颈炎组，差异有显着性（P<0.01）。采用RT-PCR法检测了Eag1 mRNA在不同缺氧条件下宫颈癌Hela细胞系的表达情况，给予不同缺氧条件，3h后Hela细胞中其mRNA的表达水平不尽相同，随缺氧程度的增加呈现先增高后降低的趋势（图4）；
采用电压钳制方式分别给3组细胞施以保持电压（holding potential，HP），对细胞进行去极化电压钳制，测试电压（test potential，TP）范围为-100～+60 mV，HP=-60 mV时，脉冲阶梯步长为20mV，刺激频率为0.2Hz。缺氧组引出15例跨膜K+电流图，随着测试电压的增大，K+电流幅值也增加，具有电压依赖性，在高钳制电压下（+80～+100 mV）K+电流具有失活趋势，膜K+电流具有内向整流特点（图6）；缺氧组K+电流峰值明显升高，差异有显着性，缺氧+4-AP组电流幅值的变化则小于单纯缺氧组。缺氧、缺氧+4-AP组和正常组Hela细胞激活的时间常数（τ） 用Clampfit程序对电流激活时间过程进行拟合，证实可用单指数进行拟合，记录到缺氧、缺氧+4-AP组和正常组Hela细胞在不同TP下激活电流曲线的时间常数τ值（见表7）。两两比较：缺氧组与缺氧+4-AP组和正常组比较差异均有显着性（P<0.01）。各组分别检测15例，缺氧组细胞膜电容虽大于其他两组，但两两比较差异无显着性（P>0.05）；电流密度比较，缺氧组明显高于对照组，缺氧+4-AP组虽有所增高，但仍显着低于单纯缺氧组 （P<0.01）
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1 资料与方法
1.1 一般资料 标本全部来自第三军医大学第三附属医院妇产科1995年12月-2008年12月诊治的病例，全部标本均经我院病理科诊断并证实，患者年龄24～77岁，平均46岁。
1.2 细胞准备
1.2.1 细胞培养 Hela细胞为本室培养的细胞株。使用含10%小牛血清的DMEM培养基，置于5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度的孵箱内培养。
1.2.2 缺氧模型 观察细胞70%～90%融合，在无菌条件下弃去大部分培养液。将混合气体（含90%N2、5%CO2、5%O2）以10L/min流量充入密闭容器，持续20min，同时关闭进气口和出气口，抽取气体经血气分析仪检测容器内O2浓度小于5%。
1.3 Eag1表达的检测
1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人Eag1单克隆抗体购自sigma公司。组织标本常规石蜡包埋，制成4μm厚切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），微波炉加热至沸后断电，间隔10min重复两次，冷却后0.02M PBS洗涤，抗原修复液修复抗原，山羊血清封闭后不洗，滴加1:150稀释的Eag1单克隆抗体，4℃过夜，0.02M PBS洗后加生物素标记羊抗兔二抗，30℃染色20min后，DAB显色，苏木素轻度复染，二甲苯透明，封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。
1.3.2 判断标准 Eag1主要定位于胞浆和（或）胞膜。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对Eag1表达做半定量评定[3]。按阳性细胞率评分：阳性细胞数占<11%为1分； 11%～50%为2分； 51%～80%为3分；>80%为4分。按显色程度评分：染色弱为1分；中等染色为2分；强染色为3分。然后将两种评分结合起来分为4级：无论染色强度如何，细胞阳性率≤10%为阴性；评2或3分者为弱阳性（+）；评4或5分为中度阳性（++）；6或7分为强阳性（+++）。若1例标本有2个染色结果，则取1个纳入统计。
1.5 全细胞膜片钳法检测Hela细胞缺氧后钾离子通道改变 应用电极拉制器用两步法拉制玻璃毛细管电极。应用Axon公司的pClamp软件中的Clampex采集数据，采样频率为10kHz，滤波频率为1～5kHz。PClamp软件输出刺激命令给膜片钳放大器，通过探头、记录电极施加到细胞内，用于钳制细胞膜电位和诱发钾离子通道电流。
1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件对结果进行处理，组间比较采用χ2检验，Fisher确切概率法计算P值，膜片钳实验获得的全部数据均用pClampB 9.0（Axon Ins，USA）软件进行分析处理，计量资料采用t检验和方差分析，P<0.05为差异有显着性，P<0.01表示为差异有非常显着性。
2 结果
Eag1在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变及宫颈鳞癌中的表达 Eag1在3种组织中均为细胞质、胞膜表达，细胞核未见表达。Eag1在慢性宫颈炎及宫颈上皮内瘤变中呈轻度着色，Eag1在宫颈鳞癌中呈中强度着色，阳性信号弥漫分布于癌巢内（图1、2、3）。Eag1在宫颈鳞癌中的表达率明显高于慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤样变组，宫颈上皮内瘤样组内Eag1表达率明显高于慢性宫颈炎组，差异有显着性（P<0.01）。采用RT-PCR法检测了Eag1 mRNA在不同缺氧条件下宫颈癌Hela细胞系的表达情况，给予不同缺氧条件，3h后Hela细胞中其mRNA的表达水平不尽相同，随缺氧程度的增加呈现先增高后降低的趋势（图4）；
采用电压钳制方式分别给3组细胞施以保持电压（holding potential，HP），对细胞进行去极化电压钳制，测试电压（test potential，TP）范围为-100～+60 mV，HP=-60 mV时，脉冲阶梯步长为20mV，刺激频率为0.2Hz。缺氧组引出15例跨膜K+电流图，随着测试电压的增大，K+电流幅值也增加，具有电压依赖性，在高钳制电压下（+80～+100 mV）K+电流具有失活趋势，膜K+电流具有内向整流特点（图6）；缺氧组K+电流峰值明显升高，差异有显着性，缺氧+4-AP组电流幅值的变化则小于单纯缺氧组。缺氧、缺氧+4-AP组和正常组Hela细胞激活的时间常数（τ） 用Clampfit程序对电流激活时间过程进行拟合，证实可用单指数进行拟合，记录到缺氧、缺氧+4-AP组和正常组Hela细胞在不同TP下激活电流曲线的时间常数τ值（见表7）。两两比较：缺氧组与缺氧+4-AP组和正常组比较差异均有显着性（P<0.01）。各组分别检测15例，缺氧组细胞膜电容虽大于其他两组，但两两比较差异无显着性（P>0.05）；电流密度比较，缺氧组明显高于对照组，缺氧+4-AP组虽有所增高，但仍显着低于单纯缺氧组 （P<0.01）
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